ANNEXE I 1
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
PRINCIPELe résidu laissé par l'extrait éthéré (éther de pétrole) du vin ou du jus de raison est minéralisé par combustion dans l'oxygène par la méthode de Schöniger. Les halogénures formés sont dosés par colorimétrie après formation de thiocyanate ferrique.
La réaction colorée, sensible à 0,01, 0,02 et 0,04 mg de chlore, brome et iode, respectivement, permet, à partir d'une prise d'essai de 100 ml de vin ou de jus de raisin, de contrôler la présence des insecticides organochlorés usuels à des teneurs supérieures ou égales à 0,2 mg/l 1. (Les insecticides organochlorés renferment de 10 à 76 p. 100 de chlore dans leur molécule).
Les essais effectués à ce jour situent entre 0,00 et 0,15 mg/l (exprimée en chlore) la teneur en halogène des vins, et entre 0,0 et 0,2 mg/l 1 (exprimée en chlore) la teneur en halogène des jus de raisin.
MATERIEL
Ampoule à décantation de 500 ml.
Evaporateur rotatif sous vide.
Appareil de mise à feu de sécurité, avec fioles de 1000 ml.
Papier à combustion.
Seringue ou pipette effilée.
Bouteille d'oxygène.
Agitateur magnétique.
Photomètre pour mesures dans le visible.
REACTIFS
a) Ether de pétrole 40-65° redistillé.
b) Acétone redistillée.
c) Sulfate de sodium cristallisé pur.
d) Solution absorbante :
Carbonate de sodium pur ... 1 g
Anhydride arsénieux ... 0,25 g
Eau distillée ... 500 ml
e) Acide perchlorique à 65 p. 100 R.P..
f) Alcool à 95° redistillé sur potasse.
g) Solution ferrique.
Dans un bécher de 250 ml, introduire 50 g d'alun de fer ammoniacal, 40 ml d'acide perchlorique à 65 p. 100, 100 ml environ d'eau distillée. Agiter. Aider la dissolution par séjour au bain-marie. Après refroidissement, transvaser dans un ballon jaugé de 200 ml et compléter au trait de jauge avec les eaux de rinçage du bécher.
h) Solution de thiocyanate mercurique :
Saturer à chaud (en tiédissant au bain-marie bouillant) 200 ml d'alcool à 95° (réactif f) avec 0,40 g de thiocyanate mercurique. Introduire dans le flacon du réactif l'alcool saturé, ainsi que l'excès de sel non dissout.
i) Solution de référence :
Solution-mère à 1000 mg de chlore par litre : dans un ballon jaugé de 100 ml, introduire 0,165 g de NaCl exactement
pesés, les dissoudre dans de l'eau distillée et compléter
au trait de jauge.
Solution à 20 microgrammes de chlore par ml : diluer de 5 à 250 ml la solution précédente.
Lavez l'éther de pétrole de la deuxième ampoule avec 20 ml environ d'eau distillée. Décantez la phase éthérée de la deuxième ampoule par son orifice supérieur dans la première ampoule.
Lavez les phases éthérées réunies avec 20 ml d'eau distillée après vidange de l'eau, décantez la phase éthérée dans un petit bécher sec et de celui-ci dans le ballon de 100 ml de l'évaporateur rotatif (en plusieurs fois).
Evaporez sous vide, en aidant l'évaporation du solvant par un léger réchauffement du ballon.
Dissolvez le résidu de l'évaporation par de l'acétone redistillée de manière à pouvoir le déposer en totalité au moyen de plusieurs lavages sur le papier spécial pour combustion maintenu au moyen de pinces, pour éviter toute souillure.
Pliez le papier et insérez-le dans le panier en platine suspendu au bouchon de la fiole à combustion.
Introduisez dans la fiole à combustion de 1000 ml :
15 ml exactement de solution absorbante d et un barreau magnétique.
Déplacez l'air par un flux d'oxygène. Bouchez la fiole. Enflammez le papier dans le dispositif de sécurité. Retirez la fiole et déposez-la sur un agitateur magnétique.
La fiole ne sera ouverte qu'après vingt minutes d'agitation. L'atmosphère à l'intérieur du ballon étant alors parfaitement éclaircie.
Colorimétrie
Prélevez exactement 10 ml de liqueur absorbante de la fiole à combustion et introduisez-les dans un ballon jaugé de 25 ml. Ajoutez ensuite, dans l'ordre, en agitant après chaque addition :
4 ml d'acide perchlorique à 65 p. 100 ;
5 ml de solution ferrique f ;
5 ml de solution de thiocyanate mercurique g.
Complétez à 25 ml avec de l'eau distillée. Agitez.
Après cinq minutes de repos, mesurez la teinte rouge obtenue à 460 microns dans des cuves de 1 cm d'épaisseur et par rapport à un témoin préparé à partir de 10 ml de solution absorbante et des différents réactifs.
Soit Dx la valeur de la densité optique observée.
Calcul
Le résultat sera calculé à partir d'une droite d'étalonnage obtenue à partir des mesures colorimétriques données par 0 - 10 - 20 ... 200 microgrammes de chlore dans la prise d'essai, c'est-à-dire en introduisant dans des ballons de 25 ml 0 - 0,5 - 1 ... 10 ml de solution à 20 microgrammes de Cl par ml.
A titre d'indication, on notera que des mesures d'étalonnage exécutées avec un spectrophotomètre ont été traduites par les relations :
Q/Cl mg = (0,24 plus ou moins 0,01) D/460 ;
Q/Br mg = (0,52 plus ou moins 0,03) D/460
Q/Cl étant la quantité de chlore en microgrammes dans la prise d'essai.
Pour tenir compte des traces d'halogènes apportées par les réactifs, il convient de retrancher à la densité optique Dx obtenue la valeur correspondant à l'ensemble des réactifs.
Pour cela, il convient de réaliser un dosage complet à partir de 60 ml d'eau distillée et 125 ml d'éther de pétrole. La densité optique obtenue à la suite de cet essai à blanc est voisine de 0,03.
L'analyse colorimétrique étant effectuée sur les 10/15 de la prise d'essai primitive, soit 100 ml d'échantillon, le résultat sera, par exemple, avec l'étalonnage précédent :
(Dx - 0,03) 0,24 x 10 = 2,4 (Dx - 0,03) mg/l de Cl.
RAISINS
Prélèvement et extraction
Opérez comme indiqué dans la méthode I-6. Utilisez 120 g de bouillie fluide pour l'extraction avec 100 et 75 ml d'éther de pétrole.
Dosage
Suivez la technique I-1.
Calcul
L'analyse colorimétrique étant effectuée sur 80 g d'échantillon, le résultat devient :
3 (Dx - 0,03) mg/kg de Cl.
ANNEXE I 2
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
PRINCIPELe résidu laissé par l'extrait benzénique du vin ou du jus de raisin est minéralisé par combustion dans l'oxygène, par la méthode de Schöniger. Après hydrolyse des pyrophosphates formés, les phosphates sont dosés par colorimétrie après réduction du phosphomolybdate d'ammonium.
La réaction colorée sensible à 5 microgrammes de phosphore permet, à partir d'une prise d'essai de 200 ml de vin ou de jus de raisin, de contrôler la présence d'insecticides organo-phosphorés (qui renferment entre 8 et 14 p. 100 de phosphore), à des teneurs supérieures à 0,3 mg/l.
Les essais effectués à ce jour situent à moins de 0,03 mg par litre la teneur en phosphore organique extrait des vins ou des jus de raisin.
MATERIEL
Identique à celui de la méthode n° 1.
REACTIFS
a) Benzène pur redistillé.
b) Sulfate de sodium cristallisé pur.
c) Solution pour l'imprégnation du papier.
NaOH ... 2,5 g.
Eau distillée ... 10 ml.
CH2 OH ... 90 ml.
d) Solution H2SO4 N.
e) Réactif molybdique :
Peser 8,3 g de molybdate d'ammonium tétrahydraté (ou 7,5 g de molybdate de sodium di-hydraté) et les dissoudre dans 200 ml d'eau distillée en tiédissant. Laissez refroidir et ajouter 100 ml d'acide chlorhydrique pur. Diluer à 500 ml avec de l'eau distillée. Mélanger. Le réactif limpide peut être utilisé immédiatement.
f) Acétate d'éthyle.
g) Solution aqueuse d'hydroquinone à 2 p. 100. A conserver au réfrigérateur et à rejeter après brunissement.
h) Solution d'acide chlorhydrique dilué au 1/10 en volume.
i) Solution aqueuse de sulfite de sodium anhydre à 15,5 g pour 100 ml.
j) Solution titrée de phosphate :
Solution-mère : dissoudre 4,394 g de phosphate monopotassique pur dans de l'eau distillée, amener à 1 litre dans un
ballon jaugé après avoir introduit 5 ml de chloroforme.
Solution de travail à 25 microgrammes de P (phosphore) par ml.
Prendre 5 ml de solution-mère et les diluer à 200 ml dans un ballon jaugé.
MODE OPERATOIRE
Extraction
Dans un flacon émeri de 500 ml, introduisez :
250 ml de vin ou de jus de raisin ;
20 à 25 g de sulfate de sodium cristallisé ;
200 ml de benzène redistillé.
Après cinq minutes d'agitation mécanique, introduisez l'extrait dans une ampoule à décantation. Après un repos suffisant pour une complète séparation des phases, évacuez la phase inférieure dans une deuxième ampoule à décantation.
Lavez la phase benzénique au moyen de 20 à 25 ml d'eau distillée qui sont ensuite récupérés dans la deuxième ampoule.
Ajoutez 100 ml de benzène dans la deuxième ampoule et agitez modérément pendant deux à trois minutes. Après séparation, évacuez la phase aqueuse. Lavez la phase benzénique avec 20 ml d'eau distillée.
Les phases benzéniques réunies sont lavées avec 20 à 25 ml d'eau distillée.
Après vidange de l'eau, filtrez la phase benzénique sur papier dans le ballon de l'évaporateur rotatif.
Evaporez sous vide en plongeant le ballon dans un bain-marie à 50-60° C et le récepteur dans de l'eau glacée.
Combustion
Plongez le papier spécial pour combustion, maintenu au moyen de pinces, dans la solution c. Faites sécher sous jet d'air froid.
Dissolvez le résidu de l'évaporation par de l'éther sulfurique de manière à le déposer en totalité au moyen de plusieurs lavages sur le papier à combustion. (Lorsque l'évaporation aura été réalisée dans un ballon de grande capacité : 500 à 1000 ml, transvasez dans un premier temps le résidu d'évaporation dans un petit bécher de 50 ml au moyen de quatre ou cinq lavages par 5 ml d'éther sulfurique. Evaporez la presque totalité de l'éther, rincez les parois du bécher avec de l'éther et déposez l'extrait éthéré sur le papier au moyen d'une seringue).
Pliez le papier et insérez-le dans le panier en platine suspendu au bouchon de la fiole à combustion. Veillez à ce que le panier soit à la distance la plus grande possible des parois du ballon, à 2 cm environ au-dessus du liquide absorbant, si nécessaire au moyen d'une rallonge en verre résistant à la chaleur placée entre le crochet du bouchon rodé et le panier.
Introduisez dans la fiole à combustion de 1000 ml :
20 ml de solution N d'acide sulfurique ;
Un barreau magnétique.
Déplacez l'air par un flux d'oxygène. Bouchez la fiole.
Enflammez le papier dans le dispositif de sécurité.
Retirez la fiole et déposez-la sur un agitateur magnétique. La fiole ne sera ouverte qu'après vingt minutes d'agitation, l'atmosphère à l'intérieur du ballon étant parfaitement éclaircie.
Prélevez 16 ml exactement de solution de la fiole à combustion, et introduisez-les dans un ballon à fond rond de 250 ml.
Maintenez une douce ébullition sous reflux pendant trente minutes.
Dosage colorimétrique
Après refroidissement dans une ampoule à décantation de 125 ml, introduisez :
Le contenu du ballon et 4 ml d'eau distillée de rinçage ;
4 ml de réactif molybdique ;
20 ml d'acétate d'éthyle.
Agitez modérément pendant une minute, laissez reposer cinq minutes. Agitez énergiquement pendant 1 minute. Une seule extraction suffit.
Evacuez la phase aqueuse sans perte de la phase organique.
Décantez la phase acétate d'éthyle par l'orifice supérieur de l'ampoule, dans une deuxième ampoule à décantation propre. Ne pas rincer.
Introduire ensuite, en agitant après chaque addition de réactif :
1 ml de sulfite de sodium anhydre à 15,5 p. 100 ;
14 ml d'eau distillée ;
1 ml d'hydroquinone à 2 p. 100 ;
1 ml d'acide chlorhydrique au dixième.
Agitez énergiquement ; laissez reposer jusqu'à séparation complète des deux phases (au moins 15 minutes) et vidangez ensuite la phase aqueuse colorée en bleu dans un ballon de 20 ml.
Rincez l'ampoule avec 1 ou 2 ml d'eau distillée, laissez reposer et complétez à 20 ml avec cette eau de lavage.
Mélangez le contenu du ballon.
Mesurez l'absorption de la solution limpide par rapport à celle de l'essai témoin (préparé à partir de 10 ml d'eau distillée et des différents réactifs) dans des cuves de 1 cm d'épaisseur, au moyen d'un photocolorimètre muni d'un écran rouge (écran n° 70 de Jobin et Yvon), ou à l'aide d'un spectrophotomètre à 720 nm.
Le résultat sera calculé à partir d'une droite d'étalonnage obtenue à partir des mesures colorimétriques données par l'équivalent de 25-50 et 75 microgrammes de phosphore (soit 1,2 et 3 ml de solution titrée de travail) en suivant la même technique. A titre d'indication, on notera que des mesures d'étalonnage ont été traduites par la relation :
q mg = (0,190 plus ou moins 0,004) x D720
q mg étant la quantité de phosphore en milligrammes dans la prise d'essai.
L'analyse colorimétrique étant effectuée sur les 8/10 de la prise d'essai primitive, soit 200 ml de vin, le résultat sera, par exemple avec l'étalonnage précédent.
(0,190 x 5 x D) mg de P par litre
ou
(0,95 x D) mg de P par litre.
ANNEXE I 3 A
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
PRINCIPELa détermination de l'activité anticholinestérasique des extraits benzéniques du vin ou du jus de raisin est réalisée par la méthode colorimétrique d'Hestrin.
L'acétylcholine réagit avec l'hydroxylamine pour former de l'acide hydroxamique qui, en présence d'ion ferrique, donne un complexe coloré en rouge.
En présence de la pseudo cholinestérase du sérum qui hydrolyse l'acétylcholine, cette réaction ne se produit pas.
En présence d'un composé organophosphoré inhibiteur de l'enzyme, l'hydrolyse de l'acétylcholine ne se produit pas et la réaction est par suite possible.
L'inhibition du volume précis de sérum sanguin utilisé dans la technique étant obtenue par des quantités limitées de chacun des insecticides organophosphorés, la méthode réalisée à partir d'une prise d'essai primitive de 10 ml de vin ou de jus de raisin, subdivisée en deux essais différents correspondant à l'équivalent de 4 et 2 ml de boisson, permet d'apprécier soit :
L'absence d'une dose supérieure à 0,05 mg/l d'insecticide organophosphoré si la réaction est négative ;
La possibilité d'une dose supérieure à 0,25 mg/l d'insecticide organophosphoré si la réaction est positive ;
Enfin, la teneur réelle lorsque l'insecticide est identifié par une technique exécutée séparément.
MATERIEL
Ampoule à décantation de 125 ml.
Bain-marie bouillant.
Tube à essai de 25 ml rodage émeri.
Bain-marie à 37,5° C.
Spectrophotomètre pour mesures dans le visible.
REACTIFS NECESSAIRES
a) Benzène pur redistillé.
b) Solution tampon :
12,52 g de Na2, HPO6, 7 OH8 ou 16,7 g de Na2 HPO4 à 12 OH2.
2,72 g de KH2, PO4.
Eau distillée Q. S. 1 litre.
Le pH doit être égal à 7,2.
c) Solution de brome :
0,4 ml de solution d'eau de brome saturée.
Eau distillée Q. S. P. 100 ml.
d) Solution de pseudo-cholinestérase :
2 ml de sérum sanguin.
Tampon Q. S. P. 25 ml.
e) Solution acétylcholine :
0,138 g chlorhydrate d'acétylcholine.
Tampon Q. S. P. 100 ml.
f) Solution alcaline d'hydroxylamine :
1. Solution de chlorhydrate d'hydroxylamine :
13,9 NH2, OH HC1.
Eau distillée Q. S. P. 100 ml.
2. Solution de soude :
14 g Na OH.
Eau distillée Q. S. P. 100 ml.
Mélanger les solutions 1 et 2 à parties égales.
g) Solution d'acide trichloracétique :
10 g d'acide trichloracétique.
30 ml d'acide chlorhydrique pur.
70 ml d'eau distillée.
h) Solution de perchlorure de fer :
10 g de Fe Cl3, 6 OH2 (ou 22,4 ml de solution Codex).
Acide chlorhydrique 0,1 N Q. S. P. 100 ml.
MODE OPERATOIRE
Extraction
Dans une ampoule à décantation de 125 ml, introduire :
10 ml de vin ou de jus de raisin ;
20 ml de benzène.
Agitez modérément pendant cinq minutes. Laissez reposer. Agitez à nouveau et laissez reposer jusqu'à complète séparation des deux phases. Centrifugez les extraits si une légère émulsion persiste. Vidangez le vin ou le jus de raisin. Décantez la phase benzénique par l'orifice supérieur de l'ampoule dans un petit bécher sec. Prélevez respectivement 8 et 4 ml de l'extrait benzénique et introduisez-les dans deux tubes à essai à rodage émeri. Evaporez juste à sec au bain-marie sous un courant d'air froid projeté au niveau du solvant au moyen d'une canne de verre.
Dosage colorimétrique
Dans une série de tubes à essai à rodage émeri numérotés, introduisez :
:================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 7 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 0 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 4 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 0 ml : : : : :================================: :================================:
: : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 2 ml : : : : :================================: Portez au bain-marie à 37,5° pendant trente minutes. :================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Solution : : : acétylcholine .. : 0 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Solution : : : acétycholine .. : 3 ml : : : : :================================: :================================:
: : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Solution : : : acétylcholine .. : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution : : : acétylcholine .. : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution : : : acétylcholine .. : 3 ml : : : : :================================: Portez au bain-marie à 37,5° pendant trente minutes. :================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: :================================:
: : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: Attendre une minute. :================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: :================================:
: : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: Filtrez et mesurez la densité optique à 540 mn dans des cuves de 1 cm d'épaisseur et par rapport au témoin tube n° 0.
:================================:
: : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : 0,00 : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : Dm : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : DM : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : Dx4 : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : Dx2 : : : : :================================: :================================:
: : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Pourcentage : : : d'inhibition .. : : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Pourcentage : : : d'inhibition .. : 0 p. 100 : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Pourcentage : : : d'inhibition .. :100 p. 100 : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :----------------: : Pourcentage : (Dx4 - Dm) 100 : : d'inhibition : -------------- : : : (DM - Dm) : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :----------------: : Pourcentage : (Dx2 - Dm) 100 : : d'inhibition : -------------- : : : (DM - Dm) : :================================: RESULTATS
1. Les densités optiques Dx 4 et Dx 2 indiquent une inhibition nulle ou inférieure à 5 p. 100.
On peut considérer globalement que ces résultats indiquent que les prises d'essai renferment moins de 0,2 micron de gramme d'insecticide organophosphoré.
Nous avons noté les valeurs suivantes :
0,05 micron de gramme de phosphamidon.
0,14 micron de gramme de parathion.
0,15 micron de gramme de malathion.
En tenant compte de l'essai sur 4 ml de boisson, ce résultat exprime l'absence d'insecticide organophosphoré à des doses supérieures à 0,05 mg/l.
2. Les densités optiques indiquent une inhibition supérieure à 90 p. 100.
S'il est possible de donner une dose moyenne minimale d'insecticide organophosphoré pour la limite inférieure de sensibilité de la méthode, la diversité des produits ne permet pas de donner une dose moyenne pour une inhibition supérieure ou égale à 90 p. 100. Cette dose sera, par exemple, de :
0,5 micron de gramme pour le parathion.
5 microns de grammes pour le phosphamidon.
12 microns de grammes pour le malathion.
La définition de la dose réelle demande une identification parallèle du produit actif.
Dans le cas des quatre produits cités, si Dx 2 montre une inhibition supérieure à 90 p. 100, la teneur sera respectivement supérieure à 0,25-2,6 et 6 mg/kg.
Dans l'ignorance de la qualité de l'insecticide organophosphoré présent, ce résultat pourra être interprété comme l'indication d'une teneur en insecticide organophosphoré supérieure à 0,25 mg/kg.
3. L'une ou les deux mesures Dx 4 et Dx 2 indiquent les inhibitions comprises entre 5 et 90 p. 100.
L'interprétation du résultat dépend également ici de la connaissance du produit actif décelé.
Les deux volumes 2 et 4 ml ont été choisis de manière à augmenter les chances de se trouver, dans l'un des cas, au voisinage de 50 p. 100 d'inhibition.
L'inhibition 50 p. 100 est obtenue respectivement avec :
0,3 micron de gramme de parathion.
0,65 micron de gramme de phosphamidon.
1,8 microns de grammes de malathion.
Après identification du produit existant, sa teneur sera déduite de la droite : pourcentage d'inhibition (en unités probits) par rapport aux logarithmes des doses précisées expérimentalement pour cet insecticide.
ANNEXE I 3 B
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
PRINCIPELa détermination de l'activité anticholinestérasique des extraits benzéniques du vin ou du jus de raisin est exécutée après oxydation préalable à l'eau de brome par la méthode électrométrique de Michel.
La technique consiste à mesurer l'abaissement de pH produit par la libération d'acide acétique.
MATERIEL
Tubes à essai, diamètre extérieur 2 cm, hauteur 11 cm.
pH mètre (de préférence à bande étalée).
Commutateur multiple à main pour mesures alternées de pH.
Quatre électrodes de verre combinées.
Bain-marie avec thermostat à 25° C.
REACTIFS NECESSAIRES
a) Eau de brome : diluez extemporanément 0,2 ml d'eau de brome saturée dans 50 ml d'eau distillée.
b) Tampon de Michel :
Barbital sodique ... 1,237 g.
Phosphate monopotassique ... 0,136 g.
Chlorure de sodium ... 17,535 g.
Eau distillée ... 900 ml.
Ajustez à pH 8 avec 11,6 ml d'HCl 0,1 N et complétez à 1000 ml avec de l'eau distillée.
c) Sérum de poulain filtré sans antibiotique. Ampoule de 10 ml. Institut Pasteur.
Sérum de poulain ... 1 ml.
Tampon de Michel ... 9 ml.
Eau distillée ... 11 ml.
e) Solution de chlorhydrate d'acétylcholine : solution extemporanée à 1 p 100 (0,25 g dans 25 ml d'eau distillée).
f) Solution aqueuse de glycérine à 10 p. 100.
MODE OPERATOIRE
Extraction
Suivre la technique indiquée dans la méthode colorimétrique (3 A).
DOSAGE POTENTIOMETRIQUE
Prenez quatre tubes de 25 ml environ pouvant recevoir chacun une électrode combinée (calomel - verre), introduisez dans les numéros 2, 3 et 4 les volumes désirés d'extrait à analyser représentant 1 et (ou) 2 g d'échantillons, ajoutez 0,1 ml de solution f, évaporez presque à sec ces extraits à basse température et introduisez successivement dans tous les tubes les divers réactifs indiqués sur le tableau suivant :
:================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: Repos trois minutes.
:================================:
: : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: Agitez.
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: : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: Agitez et disposez au bain-marie à 25° les quatre tubes dans lesquels sont plongés les électrodes combinées. Après trois minutes, vérifiez que le pH est voisin de 8. Laissez incuber trente minutes à 25° (sans retirer les électrodes). :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHOto : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pH01 : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pH02 : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pH03 : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: Laissez hydrolyser trente minutes à 25° C (sans retirer les électrodes).
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: : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHfto : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHf1 : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHf2 : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHf3 : :================================: :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :------------------: : Abaissement : DTo = : : du pH .. : (pH0to - pHfto) : : : : :================================: :================================:
: : 1 : : : Extrait : : :------------------: : Abaissement : D1 = : : du pH .. : (pH01 - pHf1) : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :------------------: : Abaissement : D2 = : : du pH .. : (pH02 - pHf2) : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :------------------: : Abaissement : D3 = : : du pH .. : (pH03 - pHf3) : : : : :================================: :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Pourcentage : : : d'inhibition .. : 0 p. 100 : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-----------------: : Pourcentage : DT0 - D1 : : d'inhibition : -------- : : : 0,01xDT0 : : : : :================================: :================================:
: : 2 : : : Extrait : : :-----------------: : Pourcentage : DT0 - D2 : : d'inhibition : -------- : : : 0,01xDT0 : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-----------------: : Pourcentage : DT0 - D3 : : d'inhibition : -------- : : : 0,01xDT0 : : : : :================================: NOTA - En raison de l'activité variable et inconnue des échantillons de sérum utilisés, il est conseillé de vérifier cette activité avant l'analyse des extraits. A cet effet, une mesure témoin sera effectuée au préalable, le sérum ne devant être considéré comme valable que si la valeur de l'abaissement du pH est supérieure à 0,8 unité de pH. RESULTATS
La sensibilité de cette technique est supérieure à celle de la méthode colorimétrique. En raison des variations d'activité des produits techniques étalons, les doses inhibitrices suivantes pour le malathion et le parathion sont données à titre indicatif seulement.
1° Inhibition nulle ou inférieure à 5 p. 100.
Les résultats obtenus indiquent que les prises d'essai renferment généralement moins de 0,05 micron de gramme d'insecticide organo-phosphoré.
Nous avons noté par exemple qu'une inhibition de 5 p. 100 était obtenue avec : 0,03 micron de gramme de malathion.
0,01 micron de gramme de parathion produisent une inhibition de 10 p. 100.
2° Inhibition de 50 p. 100.
L'inhibition de 50 p. 100 est obtenue respectivement avec : 0,16 micron de gramme de malathion et 0,08 micron de gramme de parathion.
3° Inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100.
Cette inhibition est constatée respectivement pour : 0,59 micron de gramme de malathion et 0,60 micron de gramme de parathion.
La définition de la dose réelle demande toujours une identification parallèle du produit actif.
NOTA - Technique sans oxydation préalable à l'eau de brome.
La suppression de l'étape d'oxydation à l'eau de brome rend la technique beaucoup moins sensible. A titre d'exemple, pour le parathion et le malathion, les sensibilités sont réduites aux valeurs suivantes :
1° L'inhibition voisine de 5 p. 100 est donnée par : 80 microns de grammes de malathion ou 0,85 micron de gramme de parathion.
2° L'inhibition de 50 p. 100 est donnée par : 400 microns de grammes de malathion ou 8 microns de grammes de parathion.
3° L'inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100 est donnée par :
1,400 microns de grammes de malathion ou 45 microns de grammes de parathion.
ANNEXE I 4
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
PRINCIPEL'extraction des pesticides est réalisée par l'éther de pétrole. Après évaporation de l'extrait, le résidu est chromatographié sur plaque imprégnée de gel de silice G. Merck lavée à l'eau distillée avant activation. L'élution est effectuée au moyen du mélange éther de pétrole et méthanol. Les spots sont révélés par irradiation de lumière ultra-violette à 254 microns de grammes des plaques traitées au réactif de Mitchell. Des quantités de l'ordre de 2 microgrammes de pesticides organo-halogénés peuvent être détectées très nettement, permettant à la présente méthode de révéler des doses d'insecticides organohalogénés à des doses supérieures de 0,1 mg/l avec des prises d'essai de 25 ml de vin ou de jus de raisin.
MATERIEL
Ampoules à décantation de 250 ml.
Evaporateur rotatif ou bain-marie avec soufflerie d'air froid.
Dispositif pour chromatographie en couche mince (le matériel Desaga a été utilisé).
Cuve 36 X 28 X 26 cm (de chromatographie sur papier).
Etuve.
Lampe U-V émettrice de radiations à 254 et 360 microgrammes.
REACTIFS
a) Ether de pétrole 40-65° redistillé.
b) Alcool méthylique redistillé sur potasse.
c) Acétone redistillée.
d) Sulfate de sodium cristallisé pur.
e) Gel de silice G. de Merck.
f) Mélange colorant d'essai de Desaga.
g) Réactif de révélation de Mitchell.
Dissoudre 1,7 g de nitrate d'argent dans 5 ml d'eau distillée ; ajouter 10 ml de 2-phénoxyéthanol et compléter à 200 ml avec de l'acétone. Ajouter deux gouttes d'eau oxygénée à 30 p. 100. Conserver le réactif à l'abri de la lumière et dans un flacon en verre coloré. Conservation quinze jours au maximum.
h) Mélange éluant :
h1) Ether de pétrole 40-65° redistillé, additionné de 1 p. 100 de méthanol redistillé sur potasse.
h2) Ether de pétrole à 7 p. 100 de méthanol.
k) Solution "k" : huile de paraffine à 1 p. 100 dans l'éther de pétrole.
PREPARATION DES PLAQUES
L'étalement des couches est obtenu avec le matériel Desaga Standard, en utilisant un mélange de :
25 g de gel de silice G ;
50 ml d'eau distillée,
immédiatement étalé sur plaques de verre 20 X 20 cm.
Les plaques obtenues sont séchées douze heures environ à l'air du laboratoire, dans une atmosphère à l'abri des vapeurs d'acide chlorhydrique.
Les plaques sèches sont ensuite lavées soigneusement à l'eau distillée. A cette fin, elles sont disposées dans une cuve à chromatographie renfermant une couche de 1 cm d'eau distillée. Une épaisse couche de papier filtre sec est placé au-dessus des plaques, au contact de celles-ci, de manière à absorber l'eau lorsqu'elle a parcouru toute la longueur de la plaque.
La cuve est fermée et l'ensemble est abandonné quatre heures au moins, ou mieux une nuit. Après ce lavage continu à l'eau distillée, les plaques sont abandonnées à l'air pour un séchage progressif (une à deux heures), et ensuite portées exactement une heure à l'étuve à 110° C.
Après refroidissement dans l'exsiccateur Novus, les plaques sont prêtes à l'emploi.
La migration de l'eau ayant été réalisée dans le sens de l'étalement de la couche, une bande de 1 cm environ, baignant dans l'eau, s'est désagrégée pendant le lavage. Afin d'éviter l'utilisation d'une trop grande quantité de solvant éluant, les spots seront disposés à 5 cm du bord opposé, la migration des spots devant s'effectuer dans le sens inverse de celui de la migration de l'eau distillée.
TECHNIQUE
Extraction
Introduisez successivement, dans une ampoule à décantation :
50 ml de vin ou de jus de raisin.
10 g environ de sulfate de sodium cristallisé.
50 ml d'éther de pétrole.
Agitez pendant cinq à dix minutes. Après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, vidangez la phase inférieure dans une deuxième ampoule à décantation.
Lavez l'éther de pétrole par agitation légère avec 20 ml d'eau distillée.
Ajoutez 50 ml d'éther de pétrole dans la deuxième ampoule, agitez modérément et laissez reposer.
Rejetez la phase inférieure de la deuxième ampoule, vidangez dans cette ampoule l'eau de lavage de la première ampoule, agitez et rejetez cette eau. Lavez une deuxième fois l'éther de la première ampoule avec 10 ml environ d'eau distillée qui est encore utilisée pour laver l'éther de la deuxième ampoule.
Réunissez les deux phases éthérées dans une éprouvette. Divisez l'extrait en deux parties égales dans deux béchers secs et après avoir ajouté 0,5 ml de solution k pou réduire les pertes de HCH et de gamma HCH, évaporez presque à sec au bain-marie, en projetant un jet d'air froid sur la surface du liquide. Cette évaporation pourra être réalisée dans un appareil rotatif à vide ; en ce cas, une attention particulière sera apportée à la récupération de la totalité de l'extrait réparti sur les parois du ballon.
Chromatographie
La chromatographie sera exécutée sur deux plaques distinctes pour utiliser les deux modes d'élution.
Dépôt des spots :
Par des lavages répétés à l'éther de pétrole, transférez, au moyen d'une seringue, le résidu d'évaporation, correspondant ici à 25 ml d'échantillon, sur la position de départ de la chromatographie.
Si l'évaporation a été faite dans un ballon (évaporateur rotatif) de capacité importante, rincez en un premier temps le ballon avec quelques ml d'acétone redistillée, à plusieurs reprises, en collectant les liqueurs de lavage dans un petit bécher de 50 ml ; évaporez juste à sec l'acétone, lavez les parois du bécher avec un minimum d'éther de pétrole et déposez cette dernière solution sur la plaque.
Les positions de départ sont disposées de 2 en 2 cm sur une ligne distante de 5 cm du bord de la plaque (côté opposé à celui qui a trempé dans l'eau). Les deux spots extrêmes étant à 3 cm des bords, huit positions sont disponibles.
Des solutions titrées de références seront toujours disposées sur chaque plaque pour contrôler la sensibilité et identifier éventuellement les produits décelés.
5 microlitres de solution de références contenant respectivement 1 g par litre de chacun des insecticides à rechercher, pourront être déposés soit séparément, soit simultanément si leurs Rf le permettent.
La dernière position sera occupée par quatre microlitres du mélange de colorants ; ces derniers ne sont pas séparés par le mélange à 1 p. 100 de méthanol mais ils migrent avec des Rf voisins de 0,53 - 0,56 et 0,88 avec le mélange à 7 p. 100.
Elution
La (ou les) plaques sont introduites dans la petite cuve pour chromatographie en couche mince, dont l'atmosphère est saturée par l'introduction préalable du mélange éluant à 1 p. 100 de méthanol dans l'éther de pétrole redistillé ou du mélange à 7 p. 100 de méthanol.
La hauteur de solvant dans lequel trempe la plaque ne doit pas dépasser 0,5 cm. La chromatographie dure ainsi 45 minutes environ pour un déplacement du front au-dessus de la ligne zéro des spots de 10 cm environ.
Notez la position du front dès la sortie des plaques de la cuve.
Révélation des insecticides organochlorés :
Après évaporation du solvant, pulvérisez sur toute la plaque le réactif révélateur de Mitchell.
Irradiez la plaque sous un flux de lumière ultraviolette (254 microgrammes) pendant vingt minutes.
Les taches des insecticides organochlorés sont visibles sur le fond fluorescent pendant l'irradiation et laissent des taches brunes sur fond blanc perceptibles pour des doses inférieures au microgramme, mais vraiment incontestables seulement au-dessus de 2 microgrammes.
Les plaques ont tendance à brunir par la suite, mais la lecture est encore très nette vingt-quatre heures après la révélation.
Les vins et les jus de raisin exempts d'insecticides organochlorés ne donnent aucune tache, à l'exception de la tache foncée du point de départ.
L'identité des insecticides organochlorés éventuellement observés sera déduite par comparaison de leur Rf par rapport à ceux des témoins obtenus dans le même essai.
Le dosage approximatif pourra être obtenu après un premier essai indicatif de la dose probable, par un deuxième essai encadré de doses croissantes entre 1 et 10 microgrammes de l'insecticide présumé.
A titre indicatif, les Rf suivants ont été observés :
Tableau 1 - Rf des insecticides organochlorés sur silicagel G. MERCK (élution avec de l'éther de pétrole à 1 p. 100 de méthanol) :
HEOD ... 0,05
Endrine ... 0,07
HCH technique ... 0,1 - 0,2 - 0,3 - 0,4 - 0,5
Gamma HCH ... 0,3
DDE technique ... 0,63 - 0,67
Zeidane ... 0,59 - 0,62
Heptachlore et heptachlore ep ... 0,65 - 0,68
Chlordane ... 0,6 - 0,65 - 0,7
Toxaphène ... Bande continue à 0,4 à 0,65
HHDN ... 0,75 - 0,95
Le mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol sépare les insecticides organochlorés les plus polaires comme l'endrine, l'HEOD, le chlorobenzilate, le méthoxychlore et le phaltane ainsi que quelques composés simultanément organophosphorés et organohalogénés tels que le naled et le bromophos.
Tableau 2 - Rf des insecticides organohalogénés sur Silicagel G. MERCK (élution avec l'éther de pétrole à 7 p. 100 de méthanol) :
Naled ... 0,15
Dicofol ... 0,3 - 0,9
Phaltane ... 0,34
Chlorobenzilate... 0,38
Méthoxychlore ... 0,73
Bromophos ... 0,75
HEOD ... 0,76
Endrine ... 0,80
L'utilisation séparée des deux mélanges éluants donne plus de valeur au résultat qualitatif.
Les pesticides correctement élués avec le mélange à 1 p. 100 de méthanol migrent avec le front du mélange à 7 p. 100, inversement les pesticides correctement élués avec le mélange à 7 p. 100 ne migrent pratiquement pas avec le mélange à 1 p. 100.
Lorsque l'analyse par chromatographie en couche mince sera appliquée à l'étude des éluats E1 - E2 - E3 donnés par le fractionnement sur florisil, le mélange éluant à 1 p. 100 de méthanol sera utilisé dans le cas de l'éluat E13, tandis que le mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol sera réservé à la chromatographie des éluats E2 et E9.
ANNEXE I 5
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
PRINCIPEL'extraction des pesticides est réalisée par le benzène. Après évaporation de l'extrait, le résidu est chromatographié sur plaque imprégnée de gel de silice G. Merck, lavée à l'eau distillée avant activation. L'élution est effectuée au moyen d'éther de pétrole à 7 p. 100 de méthanol. Les spots sont révélés au moyen de réactifs spécifiques des thiophosphates organiques.
Des quantités de l'ordre de 0,5 microgramme d'insecticide organothiophosphoré sont détectées en présence de l'extrait de 50 ml de vin, permettant à la méthode de révéler des teneurs en insecticides thiophosphorés supérieures à 0,01 mg/l.
MATERIEL
Identique à celui de la méthode 4.
REACTIFS
Réactifs : a - b - d - e - f - h2 de la méthode 4.
i) Ether sulfurique fraîchement redistillé.
j) Réactifs pour la révélation des chromatogrammes :
Solution A :
Ester éthylique de la tétrabromophénolphtaléine (E. Kodak n° 6810) ... 0,10 g
Acétone ... 50 ml
Solution B :
Nitrate d'argent ... 0,05 g
Eau distillée ... 25 ml
Dissoudre le sel et diluer à 100 ml avec de l'acétone distillée.
Solution C :
Acide citrique ... 5 g
Eau distillée ... 50 ml
Dissoudre l'acide dans l'eau et diluer à 100 ml avec de l'acétone distillée.
PREPARATION DES PLAQUES
Suivez la technique indiquée dans la méthode 4.
TECHNIQUE
Extraction
Introduisez successivement dans une ampoule de décantation :
50 ml de vin ou de jus de raisin.
10 g environ de sulfate de sodium cristallisé.
50 ml de benzène.
Agitez modérément pendant 5 à 10 minutes. Après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, ou éventuellement une centrifugation, vidangez la phase inférieure dans une deuxième ampoule de décantation.
Lavez le benzène par agitation légère avec 20 ml d'eau distillée.
Ajoutez 50 ml de benzène dans la deuxième ampoule, agitez et laissez reposer.
Rejetez la phase inférieure de la deuxième ampoule, vidangez dans cette ampoule l'eau de lavage de la première ampoule, agitez et rejetez cette eau. Lavez une deuxième fois le benzène de la première ampoule avec 10 ml d'eau distillée qui est ensuite utilisée pour laver le benzène de la deuxième ampoule.
Transvasez les phases benzéniques dans un bécher sec et de celui-ci dans un ballon de 100 ml de l'évaporateur rotatif (en deux temps). Evaporez juste à sec avec l'aide du vide et d'un léger réchauffement du ballon (50° C environ).
Chromatographie
Dépôt des spots
Rincez les parois intérieures du ballon de l'évaporateur avec plusieurs petits volumes d'éther sulfurique, de manière à transposer la totalité du résidu dans un petit bécher (50 ml au maximum) ; évaporez l'éther sous jet d'air froid, lavez les parois du bécher avec un minimum d'éther de pétrole et déposez entièrement cette dernière solution sur la plaque. Plusieurs reprises à l'éther de pétrole sont nécessaires pour que le dépôt soit quantitatif.
Des solutions titrées de référence seront toujours disposées sur chaque plaque pour contrôler la sensibilité et identifier éventuellement les produits décelés.
5 microlitres de solution de référence contenant respectivement 0,5 g par litre (dans l'éther de pétrole) de chacun des insecticides dont on désire contrôler la présence, pourront être disposés, soit séparément, soit simultanément en utilisant par exemple le mélange suivant :
Azinphos - malathion - parathion-méthyl - fénitrothion - parathion.
La dernière position sera occupée par 4 microlitres du mélange de colorants Desaga.
Ce mélange devra être séparé :
Le rouge Soudan G migre avec un Rf voisin de 0,53 ;
L'indophénol migre avec un Rf voisin de 0,56 ;
Le jaune beurre avec un Rf voisin de 0,88.
Elution
La plaque est introduite dans la petite cuve pour chromatographie en couche mince dont l'atmosphère est saturée par l'introduction préalable de mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol dans l'éther de pétrole redistillée.
La hauteur de solvant dans lequel trempe la plaque ne doit pas dépasser 0,5 cm. La chromatographie dure ainsi environ quarante-cinq minutes pour un déplacement du front au-dessus de la ligne de départ des spots de 10-11 cm environ.
Notez la position du front dès la sortie des plaques de la cuve.
NOTA - La migration des colorants renseigne sur la qualité de la séparation qui dépend en particulier de l'état de saturation de l'enceinte de la cuve et par suite de la température ambiante. Il est possible que l'opérateur soit amené à faire varier entre 6 et 8 p. 100 la concentration en méthanol pour tenir compte des conditions locales de température. Une enceinte thermostatique serait souhaitable.
Révélation des insecticides organothiophosphorés.
Le réactif j est spécifique des esters thiophosphoriques, l'intensité de la coloration variant avec la position du soufre dans la molécule. Il ne réagit pas avec les esters phosphoriques comme le mévinphos ne renfermant pas de soufre, et malgré la présence de nitrate d'argent, ne donne rien avec les insecticides organochlorés dans les conditions de son emploi.
Après évaporation du solvant, pulvérisez successivement sur toute la surface de la plaque, au moyen de trois pulvérisateurs garnis au préalable des réactifs A, B et C ;
1° Le réactif A : indicateur coloré ;
2° Le réactif B : nitrate d'argent ;
3° Le réactif C : acide citrique ;
Les extraits de 50 ml de vin, qui laissaient apparaître une légère traînée jusqu'au Rf 0,2 environ, avant la pulvérisation des réactifs, ne donnent plus aucune tache après pulvérisation des réactifs.
Les colorants du mélange d'essai virent, à l'exception du rouge (qui le demeure) : au rouge pour le jaune beurre, au jaune pour le bleu qui disparaît ainsi dans le fond jaune.
Les composés organo-thiophosphorés apparaissent en bleu vif sur fond jaune uni. La teinte bleu vif reste intacte pendant vingt à trente minutes, disparaît par la suite, mais laisse une trace encore perceptible après 24 heures.
Les tâches sont très apparentes au-dessus de 1 microgramme. 0,5 microgramme constitue une limite moyenne raisonnable pour la perception, mais il est indiqué de chromatographier en même temps que les extraits du vin, l'insecticide ou les insecticides dont on désire vérifier l'absence.
Cette assurance étant prise, l'absence de tache bleue dans la chromatographie d'un extrait de 50 ml de boisson indique que le produit examiné renferme moins de 0,01 mg/l desdits insecticides organothiophosphorés.
L'identité des insecticides organo-thiophosphorés éventuellement observés sera déduite par comparaison de leurs Rf par rapport à ceux des témoins obtenus dans le même essai.
Les valeurs suivantes des Rf, qui ne sont modifiés en présence de l'extrait du vin, ont été notées :
Tableau 1 - Rf des insecticides organo-phosphorés sur Silicagel G. Merck (élution méthanol 7 p. 100) :
Azinphos méthyl ... 0,21
Malathion ... 0,45
Phosalone ... 0,50
Parathion-méthyl ... 0,56
Fénitrothion ... 0,62
Diazinon ... 0,63
Phenthoate ... 0,68
Parathion ... 0,70
Bromophos ... 0,75
Fenthion ... 0,78
Carbophénothion ... 0,76
Notes :
1° Recherche de parathion :
La révélation des pesticides organophosphorés possédant un groupement nitré, comme le parathion, peut être assurée très simplement par la pulvérisation d'une solution de potasse alcoolique 2 N.
Les spots jaunes sont accentués après un séjour de cinq minutes à l'étuve à 110° et permettent de détecter 0,1 microgramme de parathion.
Si"cette recherche est effectuée sur le cinquième de l'extrait benzénique, soit l'équivalent de 10 ml de boisson, elle assure le contrôle de l'absence de résidus de parathion à une teneur supérieure à 0,01 mg/l.
2° Recherches après élution sur Florisil :
Lorsque l'analyse par chromatographie en couche mince sera appliquée à l'étude des éluats donnés par le fractionnement sur Florisil, il sera inutile de procéder à l'étude de l'Eluat E, qui ne renferme pas d'insecticides organophosphorés. Seuls les éluats E2 et E3 devront, dans ce cas, être étudiés.
ANNEXE I 6
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
PRINCIPEL'extraction des pesticides est réalisée par l'éther de pétrole. Après purification par chromatographie sur colonne de florisil, la chromatographie gazeuse avec détecteur à capture d'électrons permet de certifier l'absence d'un certain nombre d'insecticides au-dessus d'une concentration déterminée et très faible.
La présomption de l'identité des produits éventuellement détectés avec celle d'un insecticide déterminé sera établie par la concordance de diverses informations données par l'analyse complète.
MATERIEL
Ampoules à décantation de 125 ml et 500 ml, à robinets téflon et bouchons de verre rodé, non graissés, équipés de manchon téflon.
Evaporateur rotatif sous vide.
Bain-marie.
Colonne à chromatographie 20 X 600 mm à robinet téflon.
Chromatographie à détecteur à capture d'électrons.
Colonnes par chromatographie gazeuse : toute colonne généralement utilisée pour l'analyse des résidus de pesticides peut être prise, en particulier les colonnes en verre résistant à la chaleur 5° 1/8" garnies des phases DC 200 à 10 p. 100 ou QF 1 à 6 p. 100 sur un rapport habituel de 80/100 mesh, tel que le chromosorb G, etc..
Chromatographe à détecteur thermoionique et microcoulométrique.
REACTIFS
a) Ether de pétrole purifié :
L'éther de pétrole brut 40-65° ordinaire est agité mécaniquement trente minutes environ avec 5 p. 100 de son volume d'acide sulfurique concentré. Après repos, séparation de l'acide et lavage à l'eau distillée, l'éther est agité mécaniquement dans la même ampoule avec 5 p. 100 de son volume de lessive de soude 36° dilué au demi.
Après repos et séparation de la phase alcaline, lavage à l'eau distillée, le milieu est à nouveau agité trente minutes avec environ 5 p. 100 de son volume d'acide sulfurique au cinquième en volume et 3 p. 100 de son volume de solution aqueuse de permanganate de potassium à 1 p. 100.
L'éther purifié est ensuite rectifié dans une colonne rectificatrice sous un taux de reflux très faible qui permet une distillation rapide.
L'appareil à distiller entièrement en verre ne sera muni que d'un seul robinet en téflon pour le réglage du taux de reflux.
Essai de l'éther de pétrole purifié :
Concentrez à 0,5 ml dans les conditions utilisées pour les recherches de résidus (évaporateur sous vide, ou bien jet d'air froid et filtré), 50 ml d'éther de pétrole préalablement desséché par 1 g de sulfate de sodium anhydre, en présence de 0,5 ml de solution d'huile de paraffine à 1 p. 100 dans l'éther de pétrole anhydre.
Au moyen d'une seringue propre de 10 microlitres, injectez 5 microlitres de cet extrait dans les conditions de la recherche de résidus.
Il ne doit pas être observé de pic (en dehors du solvant), ou tout au moins il ne devra pas être observé de pic dépassant 10 p. 100 de l'échelle de l'enregistreur dans les conditions habituelles de sensibilité.
Un pic de cet ordre pouvant être donné par environ 0,05 ng d'insecticide organochloré, la pureté de l'éther de pétrole utilisé équivaut alors à une teneur apparente en insecticide de l'ordre de 0,0001 mg/l, soit 0,1 microgramme.
b) Eau distillée lavée :
Lavez l'eau distillée obtenue dans un appareil entièrement en verre par deux fois le quart environ de son volume d'éther de pétrole purifié.
NOTA - L'eau minérale Charrier peut être utilisée au lieu et place d'eau distillée lavée.
c) Acétonitrile fraîchement distillé sur quelques gouttes d'acide phosphorique.
d) Sulfate de sodium cristallisé R.P..
e) Sulfate de sodium anhydre pur et florisil :
Ces réactifs sont maintenus avant l'emploi quarante-huit heures au moins dans un four à 180° C.
f) Florisil :
Le florisil est ensuite conservé dans une étuve à 130° C. Prélevez, douze à vingt-quatre heures avant l'emploi, 100 g de florisil dans un petit flacon poudrier et après refroidissement, ajoutez 5 ml d'eau distillée lavée. Bouchez et agitez pour homogénéiser. Chaque lot ainsi préparé sera utilisé dans les trois jours suivants, période pendant laquelle il sera conservé à la température ordinaire.
g) Solutions de références :
A partir de produits étalons, préparez par dilutions successives des solutions de référence des insecticides à rechercher.
La première solution relativement concentrée pourra être dans l'acétone, les dilutions suivantes dans l'éther de pétrole.
Pour la recherche avec un détecteur à capture d'électrons de sensibilité moyenne, les dilutions finales seront préparées en fonction des réponses particulières de chaque insecticide, soit par exemple :
0,1 mg/l pour : gamma HCH, HCH, HHDN, HCB.
0,5 mg/l pour : HEOD, endrine.
1,0 mg/l pour zeidane, DDE, heptachlore, heptachlore-époxyde, dicofol, DDD, soufre, dichlofluanide, bromophos, phenthoate.
2,0 mg/l pour : chlordane, toxaphène.
5,0 mg/l pour : méthoxychlore, tétradifon, parathion, carbophénothion, diazinon.
20 mg/l pour : chlorobenzilate, dinocap.
h) Ether sulfurique : fraîchement redistillé, anhydre.
i) Mélange éluant :
Ether sulfurique anhydre ... 20 volumes.
Ether de pétrole purifié ... 80 volumes.
k) Solution à 1 p. 100 d'huile de paraffine dans l'éther de pétrole.
TECHNIQUE
Extraction du vin ou du jus de raisin
Introduisez dans une ampoule à décantation :
100 ml de jus de raisin ou de vin.
10 g de sulfate de sodium cristallisé R.P. (à dissoudre progressivement).
75 ml d'éther de pétrole.
Agitez modérément pendant cinq minutes et laissez reposer jusqu'à séparation des deux phases. Soutirez la phase aqueuse dans un bécher et décantez la phase éthérée dans un bécher renfermant 1 à 2 g de sulfate de sodium anhydre et de celui-ci dans un deuxième bécher sec avant transvasement dans le ballon de l'évaporateur rotatif. Epuisez à nouveau la phase aqueuse dans l'ampoule de 75 ml d'éther de pétrole. Après repos et séparation, transvasez la phase éthérée dans le ballon de l'évaporateur après décantations successives dans les deux béchers précédents. Ajoutez 1 ml de solution k et concentrez sous vide à basse température jusqu'à 10-15 ml environ.
Extraction des raisins
A partir de 2 kg de raisins, préparez un échantillon moyen de 600 g environ.
Séparez les grains. Réduisez-les en bouillie au mixeur. Pesez 100 g de bouillie fluide et introduisez-les dans un flacon de 1 litre à large col.
Ajoutez 100 ml d'éther de pétrole, traitez quelques secondes au mixeur, agitez mécaniquement 20 minutes.
Versez le mélange hétérogène sur un filtre aluminium. Filtrez le liquide ainsi séparé sur un tampon de laine de verre en recevant les liqueurs dans une ampoule à décantation.
Reversez la phase aqueuse et la pulpe retenue sur le filtre dans le flacon ; ajoutez 75 ml d'éther de pétrole, traitez quelques secondes au mixeur et agitez mécaniquement pendant 10 minutes.
Filtrez la phase éthérée dans l'ampoule à décantation après en avoir retiré le premier extrait éthéré.
Séparez la couche aqueuse.
Lavez les phases éthérées rassemblées deux fois avec 10 ml d'eau distillée lavée. Séchez l'éther sur sulfate de sodium anhydre.
Concentrez sous vide à basse température jusqu'à 10-15 ml environ.
Purification de l'extrait
a) Préparation de la colonne :
Tassez dans la colonne :
2,5 cm de sulfate de sodium anhydre.
5 cm environ de florisil (10 g).
2,5 cm de sulfate de sodium anhydre.
Lavez le contenu de la colonne par 50 ml de mélange éluant suivi de 50 ml d'éther de pétrole purifié.
b) Opération :
Après ce lavage, introduisez l'extrait éthéré concentré dans la colonne : rincez le ballon de l'évaporateur rotatif et les parois de la colonne avec de petites fractions d'éther de pétrole purifié prélevé sur une réserve de 100 ml.
Recueillez l'éluat obtenu E1 dans un bécher de 150 ml.
Introduisez ensuite successivement dans la colonne :
50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E2 ET 50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E3.
Une liste (non limitative) des pesticides qui peuvent être séparés dans les différents éluats est donnée au tableau 1.
TABLEAU N° 1
Séparation des pesticides donnée par la chromatographie
sur la colonne de florisil indiquée.
:================================: : Eluat E1 100 ml E.P. : :--------------------------------: : Soufre. : : HCB. : : HCH. : : Gamma HCH. : : Quintozène. : : Triallate (+). : : HHDN. : : : : Heptachlore. : : Heptachlore-époxyde. : : DDE. : : DDD. : : Chlordane. : : : : Zeidane. : : Toxaphène. : : : :================================: :================================:
: Eluat E2 50 ml 4 : :--------------------------------: : Diallate. : : Triallate (+++). : : Diazinon (+++). : : Fénitrothion (++). : : Ronnel. : : Fenthion. : : Parathion. : : Dicofol. : : Bromophos. : : Phenthoate. : : 2,4-D-butyl glycol ester. : : Endosulfan. : : Chlorofénizon. : : : : HEOD. : : Endrine. : : Chlorobenzilate. : : 2,4-D-alkyl cyclohexanol : : ester (85 p. 100). : : 2,4,5-T-butyl glycol ester : : (85 p. 100). : : Diéthion. : : Carbophénothion. : : Méthoxychlore. : : Dinocap. : : Tétradifon. : : : :================================: :================================:
: Eluat E3 50 ml 4 : :--------------------------------: : Parathion-méthyl. : : Dichlofuanide. : : Malathion. : : Diazinon (+). : : Fénitrothion (++). : : Phaltane. : : 2,4-D-alkyl cyclohexanol : : ester (15 p. 100). : : : : : : Endosulfan (2e pic) : : +++... E4. : : : : 2,4,5-T-butyl glycol ester : : (15 P. 100). : : : :================================: Analyse par chromatographie gazeuse
L'éluat E12 après addition de 0,5 ml de solution k est préalablement concentré à 50 ml par évaporation au bain-marie et sous jet d'air froid.
Les éluats E2 et E3 seront de même concentrés à 10 ml.
Les conditions habituelles de l'analyse chromatographique ayant été préalablement mises au point avec l'appareil disponible, injectez 4 microlitres de chacun des éluats concentrés, sur colonne garnie de silicone DC 200 ou QF 1.
En négligeant les pics donnés dans les conditions de travail favorables et par un détecteur de sensibilité moyenne par les quantités de pesticides indiquées dans la deuxième colonne du tableau suivant, l'injection effectuée permet d'assurer l'absence de teneurs supérieures à celles indiquées dans la troisième colonne du même tableau.
Si jugé utile, la limite de sensibilité pourra être abaissée en concentrant à 10 ou 5 ml les éluats (4e colonne du tableau n° 2).
TABLEAU N° 2
Limites de sensibilité de la méthode
:================================: : : : : : A : : PESTICIDES : : : :------------: : : ng : : :------------: : Groupe 1 (E1) : : : HCB .. : 0,01 : : HCH .. : 0,05 : : Gamma HCH .. : 0,05 : : HHDN .. : 0,05 : : Quintozène .. : 0,075 : : DDE .. : 0,1 : : DDD .. : 0,1 : : Zeidane .. : 0,2 : : Heptachlore .. : 0,2 : : Heptachlore- : : : epoxyde .. : 0,2 : : Chlordane .. : 0,4 : : Toxaphène .. : 0,4 : : Soufre .. : 0,4 : : : : :================================: :================================:
: : : : : B : : PESTICIDES : : : :---------------: : : à 50 ml : : :---------------: : Groupe 1 : : : (E1) : : : HCB .. : 0,002 : : HCH .. : 0,01 : : Gamma HCH .. : 0,01 : : HHDN .. : 0,01 : : Quintozène .. : 0,02 : : DDE .. : 0,02 : : DDD .. : 0,02 : : Zeidane .. : 0,05 : : Heptachlore .. : 0,05 : : Heptachlore- : : : epoxyde .. : 0,05 : : Chlordane .. : 0,1 : : Toxaphène .. : 0,1 : : Soufre .. : 0,1 : : : : :================================: :================================: : : : : : B : : PESTICIDES : : : :---------------: : : à 10 ml : : :---------------: : Groupe 1 : : : (E1) : : : HCB .. : 0,0004 : : HCH .. : 0,002 : : Gamma HCH .. : 0,002 : : HHDN .. : 0,002 : : Quintozène .. : 0,004 : : DDE .. : 0,004 : : DDD .. : 0,004 : : Zeidane .. : 0,01 : : Heptachlore .. : 0,01 : : Heptachlore- : : : epoxyde .. : 0,01 : : Chlordane .. : 0,02 : : Toxaphène .. : 0,02 : : Soufre .. : 0,02 : : : : :================================: :================================:
: : : : : A : : PESTICIDES : : : :------------: : : ng : : :------------: : GROUPE 2 (E2) : : : Ronnel .. : 0,05 : : HEOD .. : 0,1 : : Endrine .. : 0,1 : : Triallate .. : 0,1 : : Fénitrothion .. : 0,1 : : Dicofol .. : 0,2 : : Bomophos éthyl .. : 0,2 : : Phenthoate .. : 0,2 : : Endosulfan .. : 0,4 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 0,4 : : Diéthion .. : 0,5 : : Méthoxychlore .. : 1 : : Tétradifon .. : 1 : : Parathion .. : 1 : : Carbophénothion . : 1 : : Chlorofénizon .. : 1 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 1 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 1 : : Diallate .. : 1 : : Diazinon .. : 2 : : Chlorobenzilate . : 4 : : Dinocap .. : 4 : : Fenthion .. : 40 : : : : :================================: :================================:
: : : : : B : : PESTICIDES : : : :--------------: : : à 10 ml : : :--------------: : Groupe 2 (E2) : : : Ronnel .. : 0,002 : : HEOD .. : 0,004 : : Endrine .. : 0,004 : : Triallate .. : 0,004 : : Fénitrothion .. : 0,004 : : Dicofol .. : 0,01 : : Bomophos éthyl : 0,01 : : Phenthoate .. : 0,01 : : Endosulfan .. : 0,02 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 0,02 : : Diéthion .. : 0,025 : : Méthoxychlore . : 0,05 : : Tétradifon .. : 0,05 : : Parathion .. : 0,05 : : Carbophénothion : 0,05 : : Chlorofénizon . : 0,05 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 0,05 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 0,05 : : Diallate .. : 0,05 : : Diazinon .. : 0,1 : : Chlorobenzilate : 0,2 : : Dinocap .. : 0,2 : : Fenthion .. : 2 : : : : :================================: :================================:
: : : : PESTICIDES : B : : : : : :--------------: : : à 5 ml : : :--------------: : Groupe 2 (E2) : : : Ronnel .. : 0,001 : : HEOD .. : 0,002 : : Endrine .. : 0,002 : : Triallate .. : 0,002 : : Fénitrothion .. : 0,002 : : Dicofol .. : 0,005 : : Bomophos éthyl : 0,005 : : Phenthoate .. : 0,005 : : Endosulfan .. : 0,01 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 0,01 : : Diéthion .. : 0,0125 : : Méthoxychlore . : 0,025 : : Tétradifon .. : 0,025 : : Parathion .. : 0,025 : : Carbophénothion : 0,025 : : Chlorofénizon . : 0,025 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 0,025 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 0,025 : : Diallate .. : 0,025 : : Diazinon .. : 0,05 : : Chlorobenzilate : 0,1 : : Dinocap .. : 0,1 : : Fenthion .. : 1 : : : : :================================: :================================:
: : : : PESTICIDES : A : : : : : :------------: : Groupe 3 (E3) : : : Parathion-méthyl : 0,1 : : Dichlofluanide .. : 0,2 : : Phaltan .. : 0,8 : : Malathion .. : 1 : : : : :================================: :================================: : : : : PESTICIDES : B : : : : : :---------------: : : à 10 ml : : :---------------: : Groupe 3 (E3) : : : Parathion- : : : méthyl .. : 0,005 : : Dichlofluanide : 0,01 : : Phaltan .. : 0,02 : : Malathion .. : 0,02 : : : : :================================: :================================: : : : : PESTICIDES : B : : : : : :---------------: : : à 5 ml : : :---------------: : Groupe 3 (E3) : : : Parathion- : : : méthyl .. : 0,0025 : : Dichlofluanide : 0,005 : : Phaltan .. : 0,01 : : Malathion .. : 0,01 : : : : :================================: NOTA :
A - QUANTITE MINIMALE considérée comme valable pour l'analyse.
B - LIMITE THEORIQUE (en mg/l) qui en résulte après injection de 4 microlitres d'éluat provenant de 100 ml de vin concentré.
CALCUL
Lorsqu'une réponse positive est enregistrée après chromatographie sur l'une des deux colonnes DC 200 ou QF 1, l'analyse sera répétée avec le même extrait sur la deuxième colonne.
La présomption de la présence d'un insecticide déterminé sera donnée en première analyse par les critères suivants :
Possibilité de la présence de ce produit dans l'éluat E1, E2, ou E3 ;
Conformité des temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN dans les deux conditions opératoires différentes ;
Conformité des résultats quantitatifs donnés par les deux chromatographies effectuées.
Les teneurs apparentes seront calculées par comparaison entre les surfaces des pics observés et celles voisines des pics donnés par les solutions étalons dans les mêmes conditions opératoires, immédiatement avant ou après l'analyse de l'inconnu.
La surface d'un pic sera déterminée soit en utilisant les données de l'intégrateur disponible, soit par le produit de la hauteur réelle du pic par sa largeur mesurée à 54,6 p. 100 de la hauteur totale comptée à partir du sommet.
Après avoir assuré par l'une au moins des techniques indiquées plus loin (a - b - c - d) ou par l'une des méthodes précédemment exposées (méthodes 1 à 5) l'identification définitive du résidu, la teneur trouvée sera corrigée après détermination du rendement de la technique par une analyse de l'échantillon additionné avant l'extraction d'une dose connue - égale ou voisine de celle trouvée - du pesticide incriminé.
Cette détermination ne sera utile que si la teneur trouvée initialement est à la fois inférieure et du même ordre de grandeur qu'une tolérance en vigueur puisque le rendement est normalement supérieur à 80 p. 100 pour les produits stables (organo-halogénés en général) et supérieur à 60 p. 100 pour les substances à dégradation plus rapide (organo-phosphorés en particulier).
Elle ne sera pas indispensable lorsque la teneur trouvée sera supérieure à une tolérance en vigueur, notamment pour les tolérances nulles.
Identification par chromatographie gazeuse
a) Temps de rétention relatifs.
Le temps de rétention relatif trr du composé à identifier sera déterminé par chromatographie sur colonnes DC 200 et QF 1 en présence d'HHDN, élément de référence.
Les valeurs de trr seront précisées au moment de l'analyse ; les trr donnés dans le tableau 2 peuvent être consultés à titre indicatif.
TABLEAU N° 3
Temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN
:================================: : : : : INSECTICIDES : trr sur DC 200 : : : : : :-----------------: : Groupe 1 : : : (Eluat E1) : : : Soufre .. : 0,20 - 0,48 : : : - 1,07 : : HCB .. : 0,40 : : HCH (isomère : : : alpha) .. : 0,36 : : Gamma HCH .. : 0,45 : : Quintozène : 0,48 : : Triallate .. : 0,58 : : Chlordane .. : 0,7 - 0,8 - 1,5 : : : 1,65 - 2,6 : : Heptachlore : 0,79 : : HHDN .. : 1,00 : : Heptachlore- : : : époxyde .. : 1,49 : : op' DDE .. : 1,50 : : pp' DDE .. : 1,87 : : DDD .. : 2,5 : : op' DDT .. : 2,78 : : pp' DDT .. : 3,55 : : Toxaphène .. : Série de pics : : : indéterminés de : : : 2 à 6 : : : : :================================: :================================: : : : : INSECTICIDES : trr sur QF 1 : : : : : :-----------------: : Groupe 1 : : : (Eluat E1) : : : Soufre .. : 0,20 - 0,40 : : : - 0,82 : : HCB .. : 0,41 : : HCH (isomère : : : alpha) .. : 0,66 : : Gamma HCH .. : 0,82 : : Quintozène : 0,87 : : Triallate .. : 0,7 : : Chlordane .. : 0,84 - 1,4 : : : 2,0 - 2,2 : : Heptachlore : 0,88 : : HHDN .. : 1,00 : : Heptachlore- : : : époxyde .. : 2,10 : : op' DDE .. : 1,67 : : pp' DDE .. : 2,26 : : DDD .. : 4,6 : : op' DDT .. : 2,40 : : pp' DDT .. : 4,60 : : Toxaphène .. : Série de pics : : : indéterminés de : : : 1 à 6 : : : : :================================: :================================:
: : trr sur : : INSECTICIDES : DC 200 : : :--------------: : Groupe 2 : : : (Eluat E2) : : : Diallate .. : 0,37 : : Triallate .. : 0,58 : : Diazinon .. : 0,50 - 1,7 : : Fénitrothion : 0,79 : : Ronnel .. : 0,795 : : Fenthion .. : 0,84 : : Parathion .. : 0,96 : : Dicofol .. : 1,02 : : Bromophos- : : : éthyl .. : 1,16 : : Phenthoate : 1,25 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 1,58 : : Endosulfan : : : (léger) .. : 1,62 : : Chlorofénizon : 1,64 : : HEOD .. : 1,95 : : Endrine .. : 2,15 : : Chlorobenzilate : 1,94 - 2,60 : : : - 4,7 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclo-hexanol : 1,9 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 2,52 : : Diothion .. : 2,57 : : Carbophénothion : 3,1 : : Méthoxychlore : 5,4 : : Dinocap .. : 5,55 - 6 : : : 7,15 : : Tétradifon .. : 6,0 : : : : :================================: :================================:
: : trr sur : : INSECTICIDES : QF 1 : : :--------------: : Groupe 2 : : : (Eluat E2) : : : Diallate .. : 0,47 : : Triallate .. : 0,7 : : Diazinon .. : 0,77 - 1,5 : : Fénitrothion : 3,6 : : Ronnel .. : 1,44 : : Fenthion .. : 4,9 : : Parathion .. : 4,0 : : Dicofol .. : 2,1 - 2,4 : : Bromophos- : : : éthyl .. : 2,0 : : Phenthoate .. : 3,66 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 2,82 : : Endosulfan : : : (léger) .. : 2,54 : : Chlorofénizon : 6,0 : : HEOD .. : 3,32 : : Endrine .. : 4,00 : : Chlorobenzilate : 3,0 - 4,6 : : : - 8,6 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclo-hexanol : 3,08 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 4,17 : : Diothion .. : 6,1 : : Carbophénothion : 5,8 : : Méthoxychlore : 6,0 : : Dinocap .. : : : Tétradifon .. : 21,0 : : : : :================================: :================================:
: : trr sur : : INSECTICIDES : DC 200 : : :--------------: : Groupe 3 : : : (Eluat E3) : : : Parathion- : : : méthyl .. : 0,69 : : Dichlofuanide : 0,86 : : Malathion .. : 0,88 : : Diazinon .. : 0,50 - 1,7 : : Fénitrothion .. : 0,79 : : Phaltane .. : 1,36 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 1,9 : : Endosulfan : : : (lourd) .. : 2,22 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 2,52 : : : : :================================: :================================: : : trr sur : : INSECTICIDES : QF 1 : : :--------------: : Groupe 3 : : : (Eluat E3) : : : Parathion- : : : méthyl .. : 3,2 : : Dichlofuanide : 3,2 : : Malathion .. : 0,12 - 3,16 : : Diazinon .. : 0,77 - 1,5 : : Fénitrothion .. : 3,6 : : Phaltane .. : 3,92 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 3,08 : : Endosulfan : : : (lourd) .. : 4,88 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 4,17 : : : : :================================: :================================:
: : trr sur : : INSECTICIDES : DC 200 : : :--------------: : Groupe 4 : : : (non élués : : : en 1-2-3) : : : Dichlorvos .. : 0,07 : : Mévinphos .. : 0,14 : : Déméton-S : : : -méthyl .. : 0,3 : : Naled .. : 0,3 : : Diméthoate .. : 0,04 - 0,4 : : : 0,73 : : Phosphamidon .. : 0,50 - 0,66 : : Endothion .. : 0,88 : : Captane .. : 1,19 : : Difolatan .. : 3,25 : : Azinphos-méthyl : 4,2 : : Phosalone .. : 7 : : : : :================================: :================================: : : trr sur : : INSECTICIDES : QF 1 : : :--------------: : Groupe 4 : : : (non élués en : : : en 1-2-3) : : : Dichlorvos .. : 0,67 : : Mévinphos .. : 0,42 - 0,50 : : : - 0,80 - 1,0 : : Déméton-S : : : -méthyl .. : 0,85 - 2,0 : : Naled .. : : : Diméthoate .. : : : Phosphamidon .. : 0,67 : : Endothion .. : : : Captane .. : 4,5 : : Difolatan .. : : : Azinphos-méthyl : 2,14 : : Phosalone .. : : : : : :================================: b) Coefficient d'extraction (éther de pétrole, acétonitrile).
La détermination d'un coefficient d'extraction : fraction d'insecticide subsistant dans l'éther de pétrole après agitation avec un volume d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole, pourra contribuer à l'identification d'un produit inconnu.
Ce coefficient sera déterminé comme suit :
Dans une ampoule à robinet téflon de 125 ml, introduisez :
5 ml d'éluat E1 ou E2 concentré à 10 ml, par exemple, soit E cette solution.
5 ml d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole.
Agitez. Après repos et complète séparation des phases, évacuez la phase acétonitrile.
Lavez la phase éthérée avec 5 ml d'eau distillée. Filtrez la phase éthérée sur sulfate de sodium : soit E' la solution obtenue. Injectez 2 nl de cette solution dans le chromatographe.
Comparez les diagrammes correspondants aux injections de 2 microlitres de solution E et de 2 microlitres de solution E'.
Le rapport des surfaces des pics SE et SE' ayant le même temps de rétention dans les deux cas, donne la valeur p du coefficient de partage recherché.
S Quantité d'insecticide restant dans l'éther
E' de pétrole après partage
--- = ------------------------------------------- = p.
S quantité d'insecticide totale
E Les valeurs de p obtenues dans les conditions opératoires indiquées sont les suivantes :
Gamma HCH ... p = 0,24 plus ou moins 0,02
HHDN ... p = 0,92 plus ou moins 0,02
HEOD ... p = 0,46 plus ou moins 0,02
endrine ... p = 0,47 plus ou moins 0,03
pp' DDE ... p = 0,58 plus ou moins 0,02
op' DDT ... p = 0,53 plus ou moins 0,03
pp' DDT ... p = 0,37 plus ou moins 0,02
c) Analyse par microcoulométrie
Les éluats E1 et E2 dans lesquels auront été décelés des résidus d'insecticides organochlorés pourront être analysés par chromatographie gazeuse avec détecteur microcoulométrique après concentration suffisante, de manière à injecter 20 à 50 microlitres d'une solution titrant au moins 1 mg/kg de l'insecticide présumé.
d) Analyse par le détecteur thermo-ionique
Les éluats E2 et E3 dans lesquels auront été mis en évidence, au moyen du détecteur à capture d'électron, des résidus apparents d'insecticides organophosphorés pourront être soumis à l'analyse chromatographique avec détecteur thermo-ionique pour confirmer l'identité de ces composés.
Les éluats E2 et E3 seront analysés directement ou après concentration, de manière à soumettre à la chromatographie une solution titrant environ 5 mg/kg en insecticide présumé. Injectez 2 à 4 microlitres.
RECHERCHE DES INSECTICIDES PAR CHROMATOGRAPHIE EN
COUCHE MINCE
Les techniques décrites pour la recherche directe par chromatographie en couche mince des insecticides organochlorés et organothiophosphorés dans le vin peuvent être suivies sans modification (en ce qui concerne la préparation des plaques et la chromatographie) pour confirmer la présence d'éventuels insecticides dans les éluats E1, E2 et E3. Se reporter aux textes des méthodes I - 4 et I - 5.
ANNEXE I 7
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
PRINCIPELe parathon extrait du vin ou du jus de raisin par du benzène en milieu chlorhydrique est dosé par colorimétrie au moyen du chlorhydrate de N - (1 naphtyl) éthylène diamine.
Sensible à 20 microgrammes à partir de 100 ml de boisson, la technique permet le dosage de teneurs comprises entre 0,20 et 4 mg/l de parathion.
MATERIEL
Ampoule à décantation de 500 ml.
Erienmeyer de 125 ml à rodage émeri surmonté de réfrigérant à air amovible de 12 cm environ.
Evaporateur rotatif.
Spectrophotomètre.
REACTIFS
a) Benzène redistillé.
b) Sulfate de boisson cristallisé pur.
c) Alcool à 95° redistillé sur potasse.
d) Ether éthylique fraîchement distillé.
e) Acide chlorhydrique 6 N (HCl pur dilué au demi).
f) Paraffine.
g) Zinc en poudre.
h) Solution A :
Alcool à 95° ... 100 ml.
Eau distillée ... 200 ml.
Acide chlorhydrique 6 N ... 20 ml.
Solutions à préparer extemporanément :
i) Solution du nitrite de sodium à 0,25 g p. 100 ml.
j) Solution de sulfamate d'ammonium à 2,5 g p. 100 ml.
k) Réactif au chlorhydrate de N - (1 naphtyl) éthylène diamine (Eastman Kodak n° 4835) à 1,00 g p. 100 ml.
l) Solution de référence de parathion :
Préparez une dilution de parathion dans l'alcool à 95° titrée à 40 microgrammes par ml.
MODE OPERATOIRE
Extraction
Dans une ampoule à décantation de 250 ml, introduisez :
100 ml de vin ou de jus de raisin.
0,5 ml d'acide chlorhydrique dilué au demi.
15 g environ de sulfate de sodium cristallisé.
50 ml de benzène.
Agitez modérément pendant dix minutes ; après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, évacuez la phase aqueuse dans une deuxième ampoule à décantation et agitez à nouveau cinq minutes avec un nouveau volume de 50 ml de benzène. Laissez reposer.
Lavez le benzène de la première ampoule avec 10 à 15 ml d'eau distillée. Evacuez le vin épuisé de la deuxième ampoule et y introduire l'eau de lavage soutirée de la première ampoule.
Après agitation et repos, évacuez l'eau de lavage.
Refaire un deuxième lavage de la première et de la deuxième ampoule avec 10 ml d'eau distillée ; rassemblez les phases benzéniques dans le ballon de l'évaporateur rotatif.
Concentrez sous vide jusqu'à ce qu'il ne subsiste que 5 à 10 ml de liquide.
Colorimétrie
Transvasez le résidu dans un erlenmeyer.
Récupérez soigneusement le résidu au moyen de plusieurs lavages de l'intérieur du ballon par des fractions de 5 ml environ d'éther éthylique.
Evaporez au bain-marie, avec l'aide d'un jet d'air froid plongeant à l'intérieur de l'erlenmeyer, l'éther ainsi utilisé.
Introduisez ensuite dans l'erlenmeyer :
32 ml de solution A.
2 g de paraffine.
0,5 g de zinc pulvérulent.
Fixez le crachoir sur l'erlenmeyer. Abandonnez exactement dix minutes au-dessus du bain-marie bouillant. Retirez et plongez dans un bac d'eau glacée.
Disposez au-dessus d'un ballon de 100 ml un petit entonnoir muni d'un léger tampon de coton hydrophile.
Lorsque la paraffine est solidifiée, décantez le liquide sur le filtre.
Ajoutez 5 ml d'eau distillée à l'erlenmeyer et reposer sur le bain-marie jusqu'à fusion de la paraffine. Agitez. Laissez refroidir dans la glace. Filtrez à nouveau à la suite.
Recommencez deux fois cette opération (15 ml d'eau au total).
Ajoutez ensuite dans le ballon jaugé :
1 ml de nitrite de sodium à 0,25 p. 100.
Agitez quinze secondes et laissez reposer dix minutes.
1 ml de sulfamate d'ammonium à 2,5 p. 100. Agitez quinze secondes et laissez reposer dix minutes.
2 ml de réactif E. K. 4835 à 1 p. 100. Agitez quinze secondes et laissez reposer dix minutes.
2 ml d'HCl 6 N.
50 ml d'alcool à 95, ou la quantité suffisante pour compléter à 100 ml.
Mélangez. Mesurez la teinte obtenue à 555 microns dans une cuve de 1 cm d'épaisseur et par rapport à un témoin obtenu dans les mêmes conditions, en opérant à partir de 32 ml de solution A, etc..
Etalonnage
L'étalonnage sera effectué par les mesures réalisées à partir de 0 - 20 - 50 - 100 - 150 et 200 microgrammes de parathion.
A titre indicatif, un étalonnage a permis d'établir la relation :
q mg = 08 x D.
q = mg de parathion dans la prise d'essai.
Les vins et les jus de raisin exempts de parathion et de ses dérivés ne donnent aucune coloration : la densité optique étant de l'ordre de 0,003 par rapport au témoin.
Cette technique colorimétrique donne un résultat positif avec le parathion, le parathion-méthyl, le para oxon, le fénitrothion, le chlorthion, l'E. P. N. et le p nitro phénol.
ANNEXE I 8
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PRINCIPEAprès hydrolyse acide, le sulfure de carbone libéré du dithiocarbamate est absorbé par une solution alcoolique d'acétate de cuivre et de diéthanolamine. La coloration obtenue est mesurée à 435 nm.
La réaction colorée est sensible à 0,01 mg de sulfure de carbone, soit respectivement 0,018 - O,017 - 0,016 mg de zinèbe, manèbe et nabame. Exécutée à partir de 100 ml de boisson, la méthode permet les dosages de teneurs en dithiocarbamates supérieures à 0,21 mg/l.
MATERIEL
Appareil à distiller et barboteurs.
L'appareil comprend un ballon en verre résistant à la chaleur à fond rond de 1 litre porteur d'une tubulure latérale permettant une arrivée d'air au fond du liquide. Le col principal du ballon s'adapte par un rodage sphérique de 35/20 à un réfrigérant ascendant à deux boules de 15 cm de hauteur. La sortie supérieure du réfrigérant, équipée d'un rodage sphérique de 18/7 reçoit deux barboteurs 1 et 2 placés en série. Ces barboteurs sont des tubes droits d'une capacité de 30 ml dans lesquels plonge jusqu'au fond un tube effilé. Une légère aspiration au moyen d'une trompe à eau permet la circulation d'un courant gazeux refroidi dans le sens :
extérieur - ballon - réfrigérant - barboteur 1 - barboteur 2.
Spectrophotomètre pour mesure dans le visible.
REACTIFS
a) Acide sulfurique 2 N
b) Alcool absolu redistillé sur potasse.
c) Solution de référence de sulfure de carbonne à 0,10 mg par ml :
c1) Sulfure de carbone ... 1 g
Alcool absolu Q. S. P.... 100 ml
c2) Diluez c1 au 1/100 avec de l'alcool absolu.
d) Solution d'acétate de zinc à 20 p. 100
Acétate de zinc ... 20 g
Eau distillée Q. S. P.... 100 ml
e) Réactif pour la détermination de quantités de S2 C comprises entre 10 et 200 microgrammes :
Acétate de cuivre monohydraté ... 0,004 g
Diéthanolamine ... 25 g
Alcool absolu Q. S. P... 250 ml
MODE OPERATOIRE
a) Hydrolyse
Dans le ballon de 1 litre, introduisez : 100 ml de vin et 15 ml de H2 SO4 4 N.
Garnissez le premier barboteur avec 15 ml d'acétate de zinc à 20 p. 100 (pour éliminer les sulfures éventuels qui pourraient interférer sur la coloration). Garnissez le deuxième barboteur avec 12,5 ml de réactif e.
Portez le contenu du ballon à douce ébullition et ménagez une légère aspiration dans l'ensemble au moyen de la trompe à eau.
Maintenez l'ébullition et le courant d'air quarante-cinq minutes.
b) Coloration
Transvasez le contenu du deuxième barboteur dans un ballon jaugé de 25 ml. Rincez le barboteur avec de l'alcool absolu et complétez à 25 ml. Mélangez. Mesurez l'intensité de la teinte jaune après quinze minutes de repos, à 435 nm dans des cuves de 1 cm d'épaisseur et par rapport à un témoin préparé avec le réactif e dilué au demi avec de l'alcool absolu.
c) Etalonnage
Précisez la courbe d'étalonnage par la mesure des densités optiques des teintes obtenues après quinze minutes de repos, par :
10 - 25 - 50 - 75 - 100 - 150 - 200 microgrammes de sulfure de carbone dans la prise d'essai, soit respectivement :
0,1 - 0,25 - 0,5 - 0,75 - 1 - 1,5 - 2 ml de solution de référence c2 + 12,5 de réactif e.
De l'alcool absolu en quantité suffisante pour compléter à 25 ml.
A titre indicatif, des mesures ont permis de représenter la courbe d'étalonnage par l'équation.
Q mg = (0,34 plus ou moins 0,03) (D.O.).
Q = mg de sulfure de carbone dans la prise d'essai.
d) Calcul
La technique ci-dessus permet de rechercher les dithiocarbamates grâce au sulfure de carbone qu'ils sont, tous, susceptibles de libérer ; la méthode n'est pas spécifique pour un dithiocarbamate particulier. Le résultat sera donc exprimé en sulfure de carbone équivalent aux dithiocarbamates indiquant pratiquement la moitié de la concentration en dithiocarbamates métalliques présents.
ANNEXE I 9
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PRINCIPEL'extraction du dinocap (dinitro capryl phényl crotonate) est réalisée par l'éther de pétrole. Le dosage colorimétrique est effectué directement sur l'extrait concentré au moyen de pyridine. La recherche et le dosage peuvent être effectués sur un extrait purifié par chromatographie sur florisil au moyen de la chromatographie gazeuse avec détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène.
Le dosage colorimétrique, possible entre 10 et 100 microgrammes de dinocap, permet de déceler et de doser ce fongicide à des teneurs comprises entre 0,1 et 1 mg/l à partir de 100 ml de boisson.
Le dosage par chromatographie gazeuse, possible à partir de 0,2 microgrammes permet l'identification et le dosage de doses supérieures à 0,05 mg/l dans de bonnes conditions opératoires.
MATERIEL
Ampoules à décantation de 250 ml.
Evaporateur rotatif sous vide.
Spectrophotomètre pour mesures dans le visible.
Colonne à chromatographie (diamètre : 2 cm ; hauteur : 60 cm).
Chromatographe à détecteur à ionisation de flamme.
REACTIFS
a) Ether de pétrole 40-65° redistillé.
b) Sulfate de sodium anhydre.
c) Ether sulfurique fraîchement redistillé.
d) Florisil 60/100, activé par séjour à l'étuve à 130° pendant vingt-quatre heures, puis additionné de 5 p. 100 d'eau
distillée, conservé en flacon bouché et utilisé à partir de vingt-quatre heures de repos.
e) Pyridine anhydre redistillée additionnée de 1 p. 100 d'eau distillée.
f) Solutions de référence :
A - Mère : à 200 mg par litre. Dissoudre 50 mg de dinocap dans 250 ml d'éther de pétrole.
B - Solution à 20 mg par litre. Diluer au dixième la solution mère avec de l'éther de pétrole.
MODE OPERATOIRE
Extraction
Dans une ampoule à décantation de 250 ml, introduisez :
100 ml de vin ou de jus de raisin ;
75 ml d'éther de pétrole.
Agitez pendant cinq à dix minutes. Après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, vidangez la phase inférieure dans une deuxième ampoule à décantation.
Lavez l'éther de pétrole par agitation légère avec 20 ml d'eau distillée.
Ajoutez 50 ml d'éther de pétrole dans la deuxième ampoule, agitez et laissez reposer.
Rejetez la phase aqueuse de la deuxième ampoule, vidangez dans cette ampoule l'eau de lavage de la première ampoule, agitez et rejetez cette eau. Lavez une deuxième fois l'éther de pétrole de la première ampoule avec 5 à 10 ml d'eau distillée qui est encore utilisée pour laver l'éther de la deuxième ampoule.
Réunissez les deux phases éthérées dans un bécher sec, desséchez avec 5 g environ de sulfate de sodium anhydre et transvasez la solution dans un évaporateur rotatif, rincez les ampoules et le bécher avec un petit volume d'éther de pétrole qui est également introduit dans le ballon de l'évaporateur.
Si l'on dispose de ballons de 100 ml et d'un évaporateur permettant une évaporation avec alimentation progressive de ces ballons, évaporez sans atteindre la siccité : 2 à 3 ml devant subsister pour éviter les pertes.
Si l'évaporation est réalisée dans un ballon de plus grande capacité, évaporez également jusqu'à ce qu'il ne subsiste plus que quelques ml, mais pas à sec. Egouttez dans un petit bécher de 50 ml, rincez les parois du ballon avec quelques ml d'éther de pétrole anhydre, à plusieurs reprises ; évaporez l'éther sous jet d'air froid en laissant subsister de 1 à 3 ml de liquide dans le petit bécher.
Recherche et dosage
1° Colorimétrie
Dans le bécher de 50 ml renfermant l'extrait concentré, ou bien dans le petit ballon de 100 ml à large col de l'évaporateur renfermant l'extrait concentré, ajoutez 3 ml de pyridine à 1 % d'eau.
Abandonnez sous une hotte le récipient non bouché pendant une heure. Mesurez ensuite l'intensité de la coloration jaune développée par rapport à la pyridine à 1 p. 100 d'eau, à 442 nm et dans des cuves de 1cm d'épaisseur.
Etalonnage
La courbe d'étalonnage sera précisée par la mesure des densités optiques des teintes obtenues après 1 h de repos, par mélange de :
0,5, 1,0, 2,0 et 4,0 ml de solution de référence b, soit : 10, 20, 40 et 80 microgrammes de dinocap avec 3 ml de réactif pyridine à 1 p. 100 d'eau.
Remarque - L'introduction du réactif pyridine-eau dans l'extrait éthéré concentré et non sur le résidu sec d'évaporation de cet extrait évite les risques réels de pertes de l'évaporation totale de l'extrait. L'hydrolyse s'effectue normalement dans ce milieu, tandis que l'excès d'éther s'évapore spontanément à l'air libre dans le petit récipient débouché. La hotte est indiquée pour éviter de répandre dans le laboratoire l'odeur désagréable de la pyridine. Le volume final de 3 ml pourra être vérifié par simple pesée du bécher préalablement taré, la densité étant pratiquement égale à 1. Lorsque la coloration est développée, un excès d'éther de pétrole peut être éliminé sans risques de pertes par évaporation forcée sous jet d'air froid, ce qui autorise toute opération jugée utile ; pour transvaser le contenu du récipient : bécher ou ballon, dans un tube gradué, rincer avec de l'éther de pétrole et amener à 3 ml par évaporation. Ces opérations ne sont cependant pas nécessaires.
Rendement
L'étude des vins surchargés de dinocap immédiatement avant leur analyse par la méthode ci-dessus a montré que le fongicide introduit est retrouvé avec un rendement de 90 à 95 p. 100.
2° Chromatographie gazeuse
L'extrait concentré précédemment obtenu peut être utilisé pour rechercher et doser le dinocap par chromatographie gazeuse. Lorsque cette détermination, qui nécessite l'emploi de moins de 10 p. 100 de l'extrait, sera envisagée, elle pourra être effectuée avant de procéder au dosage colorimétrique sur le reste de l'extrait.
L'extrait concentré sera au préalable et en totalité purifié comme suit.
Purification
a) Préparation de la colonne :
Dans la colonne à chromatographie 20 X 600 mm, tassez successivement :
2,5 cm de sulfate de sodium anhydre.
5 cm de florisil (10 g).
1,5 cm de sulfate de sodium anhydre.
b) Mélange éluant :
Ether sulfurique fraîchement redistillé ... 20 ml.
Ether de pétrole 40-65° redistillé ... 80 ml.
c) Opération :
Lavez au préalable le contenu de la colonne par 40 ml de mélange éluant.
Introduisez ensuite le concentré de l'extrait éthéré dans la colonne, rincez le récipient et les parois de la colonne avec de petits volumes de mélange éluant, de manière à parfaitement reprendre la totalité de l'extrait. Utilisez 75 ml de mélange éluant.
L'éluat sera ensuite évaporé, sous vide, ou bien au bain-marie sous jet d'air froid, dans un petit ballon ou un bécher de 50 ml, en prenant soin de ne pas arriver à siccité. Il sera enfin concentré exactement à 0,5 ml dans un tube gradué conique :
0,45 ml pourront être utilisés pour le dosage colorimétrique.
0,05 ml serviront au dosage chromatographique.
d) Conditions de travail pour la chromatographie gazeuse :
Colonne : tube en verre résistant à la chaleur 5' 1/8'' garnie de DC 200 à 10 p. 100 sur Chromosorb W HMDS 80/100.
Température de la colonne : la température constante peut être prise entre 205 et 210°.
Température de l'injecteur : 190 à 210°.
Débit d'azote : 40 ml par mn.
Pression à l'entrée de l'appareil : 2,0 kg par cm2.
Détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène.
Sensibilité : à l'atténuation 1/40, le détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène permet le tracé de chromatogrammes avec des quantités de dinocap comprises entre 0,2 et 0,8 microgramme.
Solution de référence : la solution-mère renfermant 0,2 microgrammes de dinocap par microlitre convient aux essais témoins.
Dans les conditions indiquées ici, le dinocap donne un pic composite formé de trois pics non séparés, dont les temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN sont voisins de 5,55, 6,0 et 7,15.
Dans les conditions indiquées, le dinocap est entièrement élué en moins de 20 mn.
Ces temps de rétention relatifs seront toujours vérifiés dans les conditions particulières de chacun.
e) Recherche et dosage dans l'échantillon :
Les essais seront effectués par injections de 1 à 4 microlitres de l'extrait concentré à 0,5 ml.
L'absence de pics aux temps de rétention où est élué le dinocap peut être considérée comme l'indication de l'absence de ce produit à une dose supérieure à 0,2 microgramme dans l'essai, soit une teneur supérieure à 0,25 mg/l pour une injection de 4 microlitres de l'extrait de 100 ml de boisson concentré à 0,5 ml.
La sensibilité peut être amenée à 0,05 mg/l après concentration de l'extrait à 0,10 ml dans le tube conique gradué.
Si cette dernière détermination est jugée utile par suite de la teneur faible ou nulle de dinocap dans la boisson analysée, l'opération peut disposer de la totalité de l'extrait pour les essais chromatographiques, puisque le dosage colorimétrique a perdu son intérêt par sa sensibilité trop faible.
Le calcul du résultat sera fait comme dans tout dosage chromatographique, par comparaison entre les surfaces observées :
échantillon et étalonnages.
ANNEXE I 10
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PRINCIPELa méthode est basée sur la réaction colorée du captane (ou du phaltane) avec la résorcine à 140° C.
REACTIFS
a) Benzène distillé.
b) Résorcine pure (sèche).
c) Acide acétique glacial.
d) Octane pur : Pt Eb. : 124-126° (Eastman Kodak).
e) Décane pur : Pt Eb. : 174° (Eastman Kodak).
f) Sulfate de sodium anhydre, R.P..
g) Charbon activé "Nuchar Attaclay" Wilkens Instr. Cy..
Solution de références :
A (stock) - 50 mg dans 50 ml de benzène = 1 mg par millilitre.
B (travail) - Diluez la solution A au 1/25 = 0,04 mg par millilitre.
C (travail) - Diluez la solution B au 1/4 = 0,01 mg par millilitre.
MATERIEL
Ampoules à décantation de 250 ou 500 ml et de 50 ou 100 ml.
Kuderna-Danish ou réfrigérant adaptable par rodage à un tube à essai en verre résistant à la chaleur de 50 ml.
Evaporateur rotatif avec pompe à vide.
Spectrophotomètre (visible).
ETALONNAGE
Dans un tube en verre résistant à la chaleur de 15-50 ml à rodage émeri, adaptable à un appareil Kuderna-Danish ou à un réfrigérant de 30 cm, placez :
1 ml de solution C (soit 0,010 mg de captane) ;
1 g de résorcine ;
3,5 ml d'octane et 1,5 ml de décane (soit 5 ml du mélange des deux hydrocarbures bouillant vers 141° plus ou moins 2° C).
Faites bouillir sous reflux 10 à 15 mn modérément.
Avant refroidissement, par le haut du réfrigérant ou après avoir libéré le tube en verre résistant à la chaleur, ajoutez 3 ml d'acide acétique glacial.
Mélangez et laissez refroidir.
Transvasez le mélange dans une ampoule à décantation de 50 ml environ.
Transvasez le mélange dans une ampoule à décantation de 50 ml environ.
Rincez le tube avec 1 ml d'acide acétique.
Transvasez cet acide de lavage dans l'ampoule, sans agiter cette ampoule de manière à ne pas mélanger cet acide au précédent saturé de résorcine.
Cette précaution permet d'isoler trois phases :
La phase inférieure concentrée en résorcine est colorée en jaune ;
La phase intermédiaire est incolore ;
La phase supérieure renferme les hydrocarbures (qui pourront être récupérés pour un nouveau dosage).
Soutirez les deux phases inférieures acides dans un ballon jaugé de 10 ml, l'acide acétique de sa deuxième phase rinçant les parois de l'ampoule et la lumière du robinet.
Complétez au trait de jauge avec de l'acide acétique.
Mesurez la densité optique à 428 microns dans une cuve de 1 cm d'épaisseur par rapport à la solution témoin obtenue dans les mêmes conditions à partir de 1 ml de benzène au lieu et place de la solution C.
Normalement, la teinte de ce témoin est très faible et sa densité optique par rapport à l'acide acétique pur est de l'ordre de 0,01 indiquant que la résorcine utilisée est suffisamment pure.
Dans ce cas, l'acide acétique pourra être utilisé comme solution de référence pour les autres mesures.
Pour construire la droite d'étalonnage, opérez de même successivement avec :
0,5, 2 et 3 ml de solution C, soit respectivement 5, 20 et 30 microgrammes de captane et avec 1, 1,5 et 2 ml de solution B, soit respectivement 40, 60 et 80 microgrammes de captane.
Réduisez à 1, 1,5 ml environ par évaporation au bain-marie sous un jet d'air froid dirigé au fond du tube, lorsque le volume dépasse 1,5 ml.
Tracez la droite d'étalonnage.
NOTA - Les résultats de mesures ont permis d'écrire la relation :
microgrammes de captane dans la prise d'essai = 100 (D. 0.).
Les variations ont été trouvées inférieures à 3 p. 100 au-dessus de 10 microgrammes. Bien que moins précises, les mesures sont relativement bonnes au-dessous de 10 microgrammes, quantité pour laquelle la densité optique est égale à 0,10.
EXTRACTION DU VIN
Note importante - En raison de la toxicité à long terme du benzène, opérez toujours sous une hotte ou en atmosphère très ventilée, de manière à éviter l'inhalation de ce solvant.
Dans une ampoule à décantation de 500 ml agitez, pendant 5 mn, 100 ml de vin avec 75 ml de benzène.
Laissez reposer 20 mn et décantez le vin dans un bécher.
Décantez, par l'orifice supérieur de l'ampoule, la phase benzénique dans un bécher de 200 ml. Séchez avec 1 g environ de Na, SO, anhydre. Remettez le vin dans l'ampoule et agitez-le avec 25 nouveaux ml de benzène.
Après repos, soutirez la phase vineuse et décantez la phase benzénique dans un bécher sec.
Décantez ou filtrez la première phase benzénique dans le ballon de l'évaporateur rotatif, lavez le sulfate de sodium et le filtre avec la deuxième phase benzénique et évaporez les extraits combinés sous vide presque à sec, mais pas à siccité. Reprenez le résidu par 10 ml de benzène, et agitez avec un gramme de charbon "Nuchar attaclay", pour éliminer les pigments du vin qui interféreraient sur la couleur.
Filtrez dans le tube en verre résistant à la chaleur à rodage 45-50 ml, lavez le charbon actif par 10 ml de benzène, et réduisez le volume à 1 ou 2 ml environ, au bain-marie, sous hotte, et avec l'aide d'un jet d'air froid projeté dans l'axe du tube.
Introduisez ensuite, successivement :
1 g de résorcine ;
1,5 ml de décane et 3,5 ml d'octane.
Adaptez le dispositif réfrigérant et continuez comme il est indiqué pour la gamme d'étalonnage.
RESULTATS
A partir de 100 ml de vin, la teneur en mg/l (mg de captane par litre) se trouve être numériquement égale à la densité optique lue à 438 nm.
RENDEMENT
Le rendement de l'ensemble des opérations : extraction, purification et colorimétrie est voisin de 85 p. 100 pour des teneurs de 0,1 mg/l de captane introduites dans le vin.
La purification de l'extrait est nécessaire pour éviter une réaction parasite. Un vin rouge non traité, soumis à l'analyse sans purification de l'extrait, a donné une coloration correspondant à une teneur apparente de 0,03 mg/l de ce fongicide.
ANNEXE II
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PRINCIPELes insecticides sont extraits de la farine par agitation avec de l'acétonitrile. Après transfert dans l'éther de pétrole, la recherche et le dosage du gamma HCH et du malathion sont effectués sur deux éluats différents obtenus au cours d'une chromatographie sur florisil.
MATERIEL
Voir analyse des vins - 1 : méthode 6.
REACTIFS
Réactifs a - b - c - d - e - f - h - i et k.
Voir analyse des vins. - I : méthode 6.
g1) Solution de référence pour la recherche du gamma HCH :
A. Gamma HCH à 100 mg/l (10 mg de gamma HCH pour 100 ml d'éther de pétrole).
B. Gamma HCH à 1 mg/l. Diluez la solution A à 1 p. 100 dans l'éther de pétrole ;
A. HHDN à 100 mg/l (dissolvez 10 mg d'aldrine dans 10 ml d'acétone et complétez à 100 ml avec de l'éther de pétrole) ;
B'. HHDN à 1 mg/l. Diluez la solution A' à 1 p. 100 avec de l'éther de pétrole ;
C. Gamma HCH et HHDN à 0,25 mg/l. Dans un ballon de 100 ml, introduisez 25 ml de solution B et 25 ml de solution B' et complétez à 100 ml avec de l'éther de pétrole.
g2) Solution de référence pour la recherche du malathion :
A. Malathion à 1.000 mg/l (100 mg de malathion pour 100 ml d'acétone) ;
B. Malathion à 10 mg/l (1 ml de solution A dilué à 100 ml avec de l'éther de pétrole).
EXTRACTION
Dans un tube à centrifuger à fermeture étanche de 100 ml introduisez :
10 g de farine et 25 ml d'acétonitrile.
Après 20 mn d'agitation mécanique, centrifugez pendant 5 mn à 3.000 t/mn. Décantez le liquide surnageant dans une ampoule à décantation de 500 ml renfermant 300 ml d'eau distillée lavée et 40 ml d'éther de pétrole. Agitez. Ajoutez 20 ml d'acétonitrile au culot. Après 15 mn d'agitation et une nouvelle centrifugation, mélangez le deuxième extrait au premier dans l'ampoule. Agitez modérément. Laissez reposer. Agitez à nouveau et laissez reposer jusqu'à séparation complète des phases. Soutirez la phase aqueuse.
Lavez la phase éthérée avec 10 ml d'eau distillée lavée, soutirez cette eau de lavage, décantez l'éther dans un bécher de 100 ml renfermant 0,5 g environ de sulfate de sodium anhydre.
La phase aqueuse est épuisée avec 10 ml d'éther de pétrole qui, après séparation, lavage à l'eau et déshydratation, seront introduits à la suite de l'extrait éthéré précédent dans la colonne de florisil.
PURIFICATION DE L'EXTRAIT
Préparation de la colonne
Tassez successivement dans la colonne :
2,5 cm de sulfate de sodium anhydre ;
5 cm environ (10 g) de florisil ;
et 2,5 cm de sulfate de sodium anhydre.
Lavez la colonne absorbante successivement avec :
50 ml de mélange éluant ;
et 50 ml d'éther en pétrole,
en rejetant les effluents.
Elution du gamma HCH
Introduisez dans la colonne l'extrait précédemment obtenu (35 ml environ) après avoir disposé au-dessous d'elle un ballon jaugé de 100 ml pour recevoir l'éluat. Lorsque l'extrait a disparu dans l'absorbant introduisez dans la colonne des 10 ml d'éther de pétrole utilisés pour compléter l'extraction. Après disparition de ceux-ci, ajoutez 60 ml d'éther de pétrole dans la colonne. Retirez le ballon jauge lorsqu'il est rempli jusqu'au trait. Mélangez. Cet éluat E1 renferme la totalité du gamma HCH extrait.
1 ml d'éluat E1 correspond à 0,1 g de farine.
NOTE - Dans une analyse plus générale, pour assurer une recherche de résidus éventuels d'HHDN, zeidane, heptachlore, heptachlore-époxyde, chlordane et toxaphène, l'élution sera poursuivie avec 25 ml d'éther de pétrole supplémentaire. Après avoir recherché directement le gamma HCH (ou HCH) dans les 100 premiers ml non concentrés, la recherche des autres pesticides énumérés pourra être effectuée après concentration de la totalité des 125 ml élués.
Elution du malathion
Remplacez le ballon jaugé de 100 ml par un bécher et continuez l'élution au moyen de 125 ml de mélange à 20 p. 100 d'éther éthylique.
Les premiers 50 ml (éluat E1) pourront être rejetés ou, dans le cas d'une analyse plus générale, conservés pour la recherche d'éventuels résidus de HEOD, endrine, méthoxychlore, dicofol, tétradifon, chlorobenzylate ou parathion.
Recevez séparément les 75 ml suivants (éluat E4) qui renferment le malathion extrait éventuellement de la farine analysée.
ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE
I. - Recherche et dosage du gamme HCH
La recherche et le dosage du gamma HCH dans l'éluat E1 est effectuée par chromatographie gazeuse avec détecteur à capture d'électrons.
Les chromatographies gazeuses seront effectuées vers 160° et sous une pression variable avec la colonne et son état (1,5 à 2,5 kg par centimètre carré) capable d'assurer à la fois une valeur convenable du courant de base et une élution suffisamment lente du gamma HCH (2 à 3 mn). La chambre d'injection sera portée à 175-180°.
1° Essais témoins.
Injectez 1 microlitre de la solution C contenant 0,25 ng d'HHDN et 0,25 ng de gamma HCH à l'atténuation 1/20 (ou à l'atténuation conforme aux possibilités du chromatographe utilisé) successivement sur chacune des deux colonnes dans les conditions choisies, soit 160° et 2,5 kg/cm2 par extrait.
Notez les temps de rétention des deux insecticides, les temps de rétention relatifs du gamma HCH par rapport à l'HHDN dans les deux cas et les surfaces des pics du gamma HCH.
Les temps de rétention relatifs seront voisins de 0,45 sur DC 200 et 0,82 sur QF 1.
2° Recherche du gamma HCH dans l'éluat
L'observation de la présence du gamma HCH et son dosage chromatographique pouvant être réalisés correctement pour des quantités comprises entre 0,05 g et 0,25 ng dans la prise d'essai, une injection de 2 microlitres de l'éluat représentant 0,2 de farine permet le dosage de cet insecticide dans la farine à des teneurs comprises entre 0,25 et 1,25 mg/kg (tolérance en vigueur : 1,0 mg/kg).
En fonction du résultat obtenu, une nouvelle injection pourra être effectuée avec :
4 microlitres d'éluat pour les dosages entre 0,1 et 0,6 mg/kg.
La recherche de teneurs inférieures à 0,1 mg/kg pourra éventuellement être effectuée en utilisant un détecteur plus sensible ou encore en concentrant (dix fois au maximum) l'éluat E1, après addition de 0,5 ml de solution "k".
3° Identification
a) Mesure des temps de rétention relatifs :
Surchargez l'éluat en HHDN au moyen de la solution B' d'HHDN à 1 mg/kg dans des proportions telles que le volume injecté renferme de 0,3 à 0,6 ng d'HHDN.
Par exemple, si une injection de 2 microlitres de l'éluat convient, diluez 4 parties de cet éluat avec une partie de solution B' ; le mélange renferme 0,2 ng d'HHDN par microlitre et les 4/5 de la teneur primitive en gamma HCH.
Injectez le mélange dans les deux colonnes et calculez les temps de rétention relatifs du pic correspondant au gamma HCH dans les deux cas. La présomption de la présence du gamma HCH sera confirmée si les valeurs correspondent - à 2 p. 100 près - à celles données par les essais témoins. Soit par exemple :
b) Mesure d'un rapport d'extraction.
Afin de limiter les risques d'erreurs dus à une surcharge éventuelle du pic du gamma HCH par une substance inconnue mais de même temps de rétention relatif sur les deux colonnes - cas exceptionnel imprévisible - un deuxième contrôle de l'identité du pic observé sera effectué par la mesure d'un rapport d'extraction entre deux solvants de la substance éluée. Cette méthode sera ainsi exécutée :
Mesure témoin :
Dans une ampoule à décantation de 125 ml à robinet téflon, introduisez :
- 5 ml d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole et 5 ml de solution C.
Agitez. Après repos et complète séparation des phases, évacuez la phase acétonitrile et lavez la phase éthérée avec 5 ml d'eau distillée. Après séparation de l'eau, décantez la phase éthérée dans un petit bécher de 50 ml renfermant 0,5 g de sulfate de sodium anhydre et aussitôt après dans un tube conique gradué de 15 ml, de manière à éviter toute concentration par évaporation. Soit C1 cette solution.
Injectez 1 microlitre de solution C1 ainsi que 1 microlitre de solution C.
Soit SC1 la surface du pic du gamma HCH donnée par 1 microlitre de C1 ET sc celle donnée par 1 microlitre de C. Le coefficient particulier recherché : rapport de la quantité d'insecticide restant dans l'éther de pétrole épuisé à la quantité totale primitive est égal à :
p = SC1/SC.
Ce rapport est égal, dans les conditions indiquées, à :
p (gamma HCH) = 0,24 plus ou moins 0,02,
p (HHDN) = 0,92 plus ou moins 0,02.
Mesure relative à l'analyse :
A partir de 5 ml de solution E1 préparez une solution épuisée E'1, comme il a été indiqué pour l'essai témoin. Comparez le rapport des surfaces du pic correspondant au gamma HCH et donné par le même volume : 1 - 2 ou 4 microlitres de solution E'1 et E1.
Calculez :
px = SE'1/SE1
px devra être compris entre 0,22 et 2,6.
4° Dosage
La certitude de la présence du gamma HCH dans l'éluat ayant été acquise par les deux précédentes déterminations, le résultat quantitatif pourra être calculé à partir des surfaces des pics obtenus au cours des différents essais déjà effectués.
La teneur en gamma HCH sera calculée en fonction des volumes injectés ayant donné un résultat voisin des essais témoins avec 0,25 ng de gamma HCH. En prenant pour élément de comparaison la surface d'un pic de grandeur voisine obtenu dans les mêmes conditions opératoires avec la solution titrée de référence, la surface sera considérée comme directement proportionnelle à la quantité de gamma HCH chromatographiée.
La surface S d'un pic sera définie, soit en utilisant les données de l'intégrateur dont on dispose, soit en la calculant par la relation :
S = h x b.
h = hauteur exacte du pic.
b = largeur d'un pic à 54,6 p. 100 de sa hauteur comptée à partir du sommet.
Rendement - Le rendement de l'ensemble de l'analyse est voisin de 95 p. 100 après surcharge (à raison de 0,5 mg/kg). Aucune trace apparente de résidu n'est observée dans les farines traitées.
Note - Comme il a été indiqué plus haut, la technique ci-dessus est applicable à l'analyse de résidus éventuels des autres insecticides organochlorés élués avec l'éther de pétrole. En présence de HCH le calcul sera effectué à partir de la surface de pic de l'isomère prépondérant, dont le temps de rétention relatif sur les phases citées est respectivement égal à : 0,36 sur DC 200 et 0,65 sur QF 1.
II. - Recherche et dosage du malathion
La recherche du malathion sera effectuée par chromatographie gazeuse au moyen des colonnes utilisées pour la recherche du gamma HCH, mais à une température voisine de 185°.
La chromatographie avec détecteur à capture d'électrons sera utilisée en première analyse. Les résultats obtenus seront seulement interprétés comme donnant une preuve que la farine analysée ne renferme pas de malathion à une dose supérieure à celle apparemment observée. Si la teneur trouvée est supérieure à la tolérance en vigueur (2 mg/kg actuellement), cette teneur devra être vérifiée par une autre technique : analyse avec détecteur thermo-ionique ou microcoulométrique avant d'être acceptée comme exacte.
A. - Analyse avec le détecteur à capture d'électrons
1° Essais témoins :
Injectez 1 microlitre de la solution B, soit 10 ng de malathion sur colonne DC 200 à température voisine de 190° et sur colonne QF 1 vers 175°.
Les temps de rétention relatifs du malathion (par rapport à L'HHDN) sur ces phases sont voisins de 0,9 sur DC 200 et 0,12 (petit pic) et 3,2 (pic principal) sur QF 1.
2° Recherche du malathion dans l'éluat E2 :
Evaporez sous vide, dans un évaporateur rotatif, les 75 ml de mélange élué E2.
Concentrez à 5 ml.
1 ml de cet extrait concentré équivaut à 2,0 g de farine.
Injectez 4 microlitres (soit l'équivalent de 8 mg de farine) sur colonne DC 200 et QF 1, dans un chromatographe équipé d'un détecteur à capture d'électron.
L'identification est assurée par l'identité des temps de rétention de l'inconnu et du témoin sur les deux phases DC 200 et QF 1.
Evaluez la teneur en malathion de la farine analysée par comparaison entre les surfaces des pics donnés par l'extrait analysé et des surfaces de grandeurs voisines données par des essais témoins dans les mêmes conditions opératoires.
L'analyse est correcte pour la chromatographie de 4 à 20 ng de malathion, correspondant à des farines dont la teneur en malathion varie entre 0,5 et 2,5 mg/kg.
Les résultats supérieurs à la tolérance (2 mg/kg) devront être confirmés par une des deux méthodes spécifiques suivantes :
B. - Analyse avec le détecteur thermo-ionique
1° Préparation du détecteur thermo-ionique :
La tête habituelle du détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène sera surélevée de 9 mm au moyen d'un élément cylindrique posé sur l'embase normale. Pour réaliser un détecteur thermo-ionique, formez avec un fil de platine (10 cm) deux séries de quatre spires reliées entre elles par une partie droite du fil.
La spirale inférieure a pour objet de maintenir fermement sur le brûleur les spires supérieures enrobées d'un globule de sel alcalin fondu. Pour préparer ce globule, retirez le fil du tube de quartz et plongez les spires supérieures dans un bain de carbonate de potassium, pur pour analyse, fondu dans un creuset de platine. Après refroidissement du sel, creusez, dans l'axe du globule formé, un conduit de 0,7 mm de diamètre et posez la spirale sur le brûleur, de manière à ce que les gaz traversent le globule et puissent brûler à la sortie de celui-ci.
Pour assurer un fonctionnement correct du détecteur, le débit de l'air, admis dans la tête du détecteur, sera réduit à 150 ml par mn (au lieu de 200 ml par mn utilisés dans le détecteur normal). Le débit de l'hydrogène sera réglé en fonction de la réponse obtenue (22 ml par mn conviennent).
Opérez presque à la limite, ou à la limite des possibilités de compensation données par l'appareil utilisé.
2° Essais témoins :
Injectez 2 microlitres de la solution B, soit 20 ng de malathion sur colonne DC 200, à une température voisine de 190° C, l'effluent à la sortie de la colonne étant divisé en deux parties égales dirigées, l'une vers un détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène normal, l'autre vers le détecteur thermoionique.
Le réglage des débits d'air et d'hydrogène et l'atténuation seront choisis de manière que 10 ng de malathion donnent une réponse égale à 50 p. 100 environ de l'échelle de l'enregistreur. Dans les mêmes conditions opératoires, le détecteur normal ne donne aucune réponse ; une réponse analogue ne serait donnée qu'avec 5 microlitres environ de malathion.
Cette opération peut également être réalisée avec deux injections dans deux appareils, l'un équipé d'un détecteur thermoionique, l'autre du détecteur habituel à ionisation de flamme d'hydrogène.
3° Recherche et dosage du malathion dans l'éluat E3 :
Amenez par évaporation, à 2 ml, l'éluat E3, précédemment concentré à 5 ml.
Injectez 4 microlitres de cet extrait.
Evaluez la teneur en malathion de la farine par comparaison avec des chromatogrammes-étalons ayant des surfaces voisines et obtenus dans les mêmes conditions opératoires.
L'analyse est correcte à partir de 5 ng dans l'injection, soit pour des teneurs supérieures à 0,25 mg/kg de malathion dans la farine.
Un contrôle analogue serait réalisé par deux injections de 2 microlitres dans deux appareils distincts.
C. - Analyse avec le détecteur microcoulométrique
Le microcoulomètre Dohrmann G 250, équipé de la cellule T 300 P. assure l'analyse spécifique des dérivés soufrés grâce au titrage iodométrique de l'anhydride sulfureux produit par une combustion préalable de l'échantillon dans l'oxygène.
Adapté à la sortie d'un chromatographe équipé d'une colonne assurant la séparation des pesticides, soit par exemple une colonne en verre résistant à la chaleur 1,20 m X 6 mm garnie de DC 200 à 10 p. 100 sur chromosorb G 60/80, ce détecteur permet la mise en évidence du malathion qui renferme 19,4 p. 100 de soufre.
Injectez 50 microlitres de l'extrait E3 concentré à 2 ml.
L'analyse est correcte à partir de 50 ng de malathion dans l'injection, soit pour des teneurs supérieures à 0,2 mg/kg dans la farine sans procéder à une nouvelle concentration.
Rendement - Le rendement de l'ensemble de la méthode est voisin de 70 p. 100 pour une surcharge de 1 mg/kg de malathion dans la farine.
ANNEXE III
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
PRINCIPELa méthode indiquée permet :
D'estimer globalement la présence éventuelle de résidus de pesticides organochlorés par le dosage des halogènes organiques extractibles par solvant :
De contrôler la présence de résidus de pesticides organophosphorés par la mesure de l'activité anticholinestérasique d'un extrait de l'échantillon ;
De rechercher un certain nombre de pesticides par des techniques chromatographiques.
MATERIELS ET REACTIFS
Se reporter aux textes précédents traitant la recherche des résidus de pesticides dans le vin et dans la farine.
TECHNIQUE
Préparation de l'échantillon
La validité de l'échantillon primitif ayant été assurée par les inspecteurs chargés de cette opération, le laboratoire de chimie reçoit un échantillon de 2 à 3 kg.
Echantillon primaire - Après élimination des parties non comestibles, dont le pourcentage en poids par rapport à l'échantillon entier sera noté, divisez au hachoir en petits fragments de 2 à 3 cm la totalité de l'échantillon à analyser (2 à 3 kg). Mélangez.
Les fruits ne seront pas pelés à l'exception des agrumes dont l'analyse sera effectuée selon un protocole particulier.
Echantillon secondaire - Réduisez au hachoir électrique en morceaux ou en tranches fines, 700 g environ de mélange primaire, de manière à obtenir 600 g environ de mouture. Homogénéisez cette mouture.
Echantillon tertiaire - Réduisez en purée ou en parties fines, au mixeur, 350 g environ du mélange secondaire pour obtenir le mélange final qui sera utilisé pour l'extraction.
Déterminez l'humidité de l'échantillon tertiaire sur 5 g de celui-ci.
Préparation de l'extrait
L'analyse pourra comporter :
1. Une détermination des halogènes totaux extractibles par solvant à partir d'une prise d'essai initiale 120 g qui sera utilisée en totalité pour cette détermination.
2. La détermination de l'activité anticholinestérasique de l'extrait.
3. Une recherche par chromatographique gazeuse d'un certain nombre d'insecticides connus sur 50 g d'échantillon.
4. Une recherche particulière par chromatographie en couche mince ou toute autre méthode sur l'équivalent de 50 g d'échantillon.
En fonction des opérations de contrôle désirées ou possibles, le poids d'échantillon tertiaire à utiliser pour l'extraction pourra être de :
75 g pour l'analyse chromatographique et enzymatique, en conservant une partie de l'extrait pour des recherches complémentaires.
120 g pour le dosage des halogènes extractibles par solvant.
La technique d'extraction sera la même dans chaque cas, mais elle sera appliquée selon les modalités suivantes :
Extraction pour l'analyse chromatographique et enzymatique
a) Cas général (raisins et agrumes exceptés).
Introduisez l'échantillon tertiaire de 75 g dans un flacon à large col et ajoutez :
200 ml d'acétonitrile.
Mixez quelques secondes pour homogénéiser.
Agitez mécaniquement 30 mn.
Décantez le liquide dans le ballon de l'évaporateur rotatif en le filtrant sur un petit tampon de laine de verre résistant à la chaleur.
Exprimez fortement.
Reprenez la masse de l'échantillon avec 100 ml d'acétonitrile et agitez à nouveau mécaniquement pendant 20 mn. Filtrez sur la même laine de verre le nouvel extrait. Exprimez fortement à nouveau.
Evaporez l'acétonitrile au moyen d'un évaporateur rotatif, la température du bain-marie ne dépassant pas 45°.
Extrayez le résidu aqueux dans une ampoule à décantation avec 100 ml, puis avec 50 ml d'éther de pétrole purifié, séchez l'extrait avec du sulfate de sodium anhydre.
Concentrez au bain-marie sous jet d'air froid jusqu'à 7,5 ml.
1 ml d'extrait brut concentré à 7,5 ml correspond à 10 g de fruit ou de légume.
b) Cas des agrumes : (méthode à l'isopropanol - éther de pétrole).
Pesez l'échantillon d'agrume à analyser, soit un lot de 4 fruits, séparez les zestes et déterminez leur pourcentage en poids dans les fruits entiers.
Soit p la fraction décimale correspondante.
Réduisez au hachoir électrique les zestes en menus fragments.
Après mélange, pesez exactement :
(75 p) grammes de zestes (soit par exemple, si p = 0,28) :
75 X 0,28 = 21 g de zestes d'oranges en comportant 28 p. 100. Introduisez cet échantillon tertiaire dans un flacon à large col de 1 litre et ajoutez :
4 X (75 p) ml d'alcool isopropylique (soit 4 X 21 = 84 ml dans l'exemple choisi) ;
Et 2 X (75 p) ml d'éther de pétrole (soit 2 X 21 = 42 ml dans l'exemple choisi).
Actionnez un mixeur quelques secondes pour homogénéiser.
Agitez mécaniquement pendant 30 mn.
Filtrez le liquide à travers un tampon de laine de verre résistant à la chaleur dans une ampoule de décantation de 500 ml.
Reprenez la masse de l'échantillon avec 2 (75 p) ml d'éther de pétrole.
Agitez pendant 20 mn supplémentaires.
Filtrez le liquide sur le même tampon de laine de verre en recevant le filtrat dans la même ampoule à décantation.
Ajoutez : 8 X (75 p) ml d'eau pure.
Agitez et après séparation des phases évacuez la phase aqueuse.
Ajoutez 25 ml d'eau pure, agitez, rejetez la phase aqueuse après séparation.
Séchez la phase éthérée sur sulfate de sodium avant de la concentrer par évaporation à 7,5 ml.
1 ml d'extrait brut concentré à 7,5 ml correspondant à 10 g de fruit entier.
1° Dosage des halogènes totaux extractibles par solvant.
La présence de chlorures naturels dans les extraits d'une part et la sensibilité limite du dosage colorimétrique d'autre part rendent la détermination de la teneur en chlorures extractibles par solvant inadéquate pour la recherche des résidus à des taux inférieurs à 0,4 mg/kg dans la majorité des fruits et des légumes.
Indiquée principalement pour contrôler l'absence de dépôts anormaux d'insecticides organochlorés à des teneurs supérieures à 1 mg/kg, cette technique sera appliquée sur un extrait obtenu dans les conditions suivantes :
Extraction :
Traitez un échantillon tertiaire de 120 g dans les conditions décrites précédemment en utilisant successivement les volumes suivants de solvant :
acétonitrile : 200 et 100 ml ;
éther de pétrole : 100 et 50 ml.
Evaporez presque à sec, au bain-marie et sous jet d'air froid dans un tube conique, l'extrait éthéré ainsi obtenu. Lavez les parois du tube avec de petites fractions d'acétone, évaporez l'acétone à l'aide d'un jet d'air froid jusqu'à 0,4 ml environ.
Prélevez l'extrait ainsi concentré au moyen d'une seringue de 1 ml et déposez-le avec précaution sur le papier spécial pour combustion maintenu à l'aide de pinces pour éviter toute souillure. Répétez les opérations de rinçage à l'acétone jusqu'à transfert complet du résidu sur le papier.
Continuez les opérations de combustion et de dosage en suivant la technique décrite au sujet de l'analyse des vins.
L'analyse colorimétrique est effectuée sur l'équivalent de 80 g d'échantillon.
La teneur en chlore est donnée par la relation :
1000
(D. O.) 0,24 ---- = 3. (D. O.) mg/kg
80
(D. O.) étant la densité optique lue par rapport à un témoin effectué avec l'ensemble des réactifs.
En raison des taux variables et mal définis d'halogènes organiques naturels dans les végétaux cette méthode conviendra pour observer l'absence de résidus au-dessus de la teneur donnée par l'analyse. Cette teneur est généralement inférieure à 0,4 mg/kg, exprimée en chlore.
2° Contrôle de l'activité anticholinestérasique de l'extrait.
La présence des résidus d'insecticides organophosphorés inhibiteurs de la cholinestérase peut être contrôlée par la mesure directe de l'activité anticholinestérasique de l'extrait non purifié.
Après prélèvement de 5 ml (sur les 7,5 ml disponibles) pour l'analyse chromatographique, diluez à 10 ml les 2,5 ml restants avec de l'éther de pétrole.
0,4 ml de cet extrait étendu représente 1 g d'échantillon.
Les mesures de l'activité anticholinestérasique pourront être exécutées, soit par la méthode colorimétrique, soit par la méthode potentiométrique en suivant les protocoles indiqués au sujet de l'analyse des vins (méthodes I-3 A - I-3 B).
Les déterminations seront exécutées en double sur une partie aliquote de l'extrait équivalente à 2 g d'échantillon avec la méthode colorimétrique ou 1 g d'échantillon avec la méthode potentiométrique. La prise d'essai sera réduite à l'équivalent de 0,5 g dans le cas des agrumes.
L'évaporation de l'extrait éthéré dans le tube à réaction, avant addition de l'eau de brome, sera effectuée en présence de 0,1 ml de solution aqueuse de glycérine à 10 p. 100.
Dans chacune des deux méthodes, la teneur réelle en insecticide organophosphoré ne peut être déterminée qu'après identification du résidu, report à la courbe d'étalonnage particulière au pesticide mis en évidence et étude du rendement dans chaque cas particulier.
Lorsque l'identité du produit anticholinestérasique décelé ne sera pas connue, sa teneur sera exprimée en concentration apparente en parathion, telle qu'elle est indiquée par la comparaison des inhibitions constatées et de la droite d'étalonnage obtenue avec le parathion.
3° Recherche des insecticides par chromatographie gazeuse.
Principe :
Une élution sélective sur colonne de florisil permet de séparer de l'extrait brut une série de pesticides dont la présence est ensuite recherchée dans les différents éluats successifs par chromatographie gazeuse avec détecteur à capture d'électron.
La sensibilité de ce type de détecteur aux principaux insecticides organochlorés usuels permet de contrôler leur absence dans l'échantillon analysé au-dessus de teneurs variables avec l'insecticide et la concentration choisie.
Lorsque cette analyse mettra en évidence des résidus apparents d'insecticides à des taux supérieurs aux tolérances, un contrôle plus complet sera mis en oeuvre : étude sur plusieurs colonnes, mesure d'un coefficient d'extraction, chromatographie en couche mince, colorimétrie ou microcoulométrie pour obtenir confirmation du résultat de la première analyse.
La sensibilité plus faible du détecteur à capture d'électron aux insecticides organophosphorés sera compensée par une concentration des éluats ; cependant, la polarité plus élevée de ces insecticides limite le nombre de ceux qui peuvent être élués dans les conditions choisies.
L'identification pourra être confirmée par analyse au moyen du détecteur thermoionique, par l'analyse enzymatique ou par chromatographie sur couche mince.
Purification de l'extrait :
5 ml de l'extrait de 75 g d'échantillon concentré à 7,5 ml, soit l'équivalent de 50 g de produit à analyser, sont chromatographiés sur colonne de florisil dans les conditions décrites dans la méthode de contrôle du vin (méthode I-6) ou de la farine (méthode II).
Après lavage de la colonne avec 50 ml de mélange éluant i et 50 ml d'éther de pétrole, introduisez les 5 ml d'extrait éthéré concentré et éluez successivement avec :
100 ml d'éther de pétrole pour obtenir l'éluat E1 ;
50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E2 ;
50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E3.
Une liste (non limitative) des pesticides qui peuvent être obtenus dans les différents éluats est donnée au tableau 1.
TABLEAU N° 1
Séparation des pesticides donnée par la chromatographie
sur la colonne de florisil indiquée
:================================: : Eluat E1 : Eluat E2 : : 100 ml/E.P. : 50 ml/4 : :-------------:------------------: : Soufre : Diallate : : HCB : Triallate : : : (+++) : : HCH : Diazinon : : : (+++) : : Gamma HCH : Fénitrothion : : : (++) : : Quintozène : Ronnel : : Triallate : : : (+) : Fenthion : : HHDN : Parathion : : : Dicofol : : Heptachlore : Bromophos : : Heptaclhore : : : - époxyde : Phenthoate : : DDE : 2,4-D-Butyl : : : glycol ester : : DDD : Endosulfan : : Chlordane : Chlorofénizon : : : : : Zeidane : HEOD : : Toxaphène : Endrine : : : Chlorobenzilate : : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol : : : ester : : : (85 p. 100) : : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol ester : : : (85 p. 100) : : : Diéthion : : : Carbophénothion : : : Méthoxychlore : : : Dinocap : : : Tétradifon : : : : :================================: :================================:
: Eluat E1 : Eluat E3 : : 100 ml/E.P. : 50 ml/4 : :-------------:------------------: : Soufre : Parathion-méthyl : : HCB : Dichlofluanide : : HCH : Malathion : : Gamma HCH : Diazinon (+) : : Quintozène : Fénitrothion : : : (++) : : Triallate : Phaltane : : (+) : : : HHDN : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol : : : ester : : : (15 p. 100) : : Heptachlore : : : Heptaclhore-: : : époxyde : : : DDE : Endosulfan : : : (2e pic) : : : +++ ... E4 : : DDD : : : Chlordane : 2,4,5-T butyl : : : glycol ester : : : (15 p. 100) : : Zeidane : : : Toxaphène : : : : : :================================: Les pesticides du groupe 4 signalés au tableau 3 (méthode I-6) ne sont pas élués dans ces conditions.
Analyse par chromatographie gazeuse :
L'éluat E4, après addition de 0,5 ml de solution k, est préalablement concentré à 50 ml par évaporation au bain-marie et sous jet d'air froid. Les éluats E2 et E3 sont réduits à 10 ml dans les mêmes conditions.
Après injection de 4 microlitres de chacun des éluats ainsi concentrés, les limites de sensibilité de la méthode, calculées sur la base de valeurs moyennes des quantités minimales détectables, correspondent au double des valeurs données dans la troisième colonne du tableau 2 (Méthode I-6) puisque la prise d'essai est réduite ici à 50 g au lieu de 100 ml de vin.
Ces limites peuvent être abaissées, si jugé utile, en réduisant l'éluat E1 à 10 ml et les éluats E2 ou E3 à 5 ml.
NOTA - Analyse des carottes
Dans l'analyse des carottes, des produits naturels non halogénés produisent irrégulièrement des interférences gênantes pour l'interprétation des chromatogrammes de l'éluat E2 concentré, avec le détecteur à capture d'électrons. Pour éviter cet inconvénient et permetre la recherche sans difficulté de l'HEOD à des teneurs inférieures à 0,01 mg/kg, le mélange éluant i pourra être remplacé par un mélange chlorure de méthylène-éther de pétrole (25 p + 75 P).
L'analyse sera limitée à l'étude de l'éluat E1 habituel et à celle du nouvel éluat E'2 obtenu avec 50 ml du nouveau mélange éluant.
L'éluant E'2 devra être évaporé à sec - en présence de 0,5 ml de solution k - pour éliminer toute trace de solvant chloré. Le résidu sec sera repris par 5 ml d'éther de pétrole pour l'analyse chromatographique.
L'élution ainsi réalisée permet d'isoler l'HEOD, l'endrine et le méthoxychlore ; le dicofol et le tétradifon ne sont que partiellement élués tandis que le parathion et le fénitrothion ne le sont pas.
Les interférences naturelles sont reportées à l'éluation suivante.
Calcul
Lorsqu'une réponse positive est enregistrée après chromatographie sur l'une des deux colonnes DC 200 ou QF 1, l'analyse sera répétée avec le même extrait sur la deuxième colonne.
La présomption de la présence d'un insecticide déterminé sera donnée en première analyse par les critères suivants :
Possibilité de la présence de ce produit dans l'éluat E1-E2 ou E3 ;
Conformité des temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN dans les deux conditions opératoires différentes ;
Conformité des résultats quantitatifs donnés par les deux chromatographies effectuées.
Les teneurs apparentes seront calculées par comparaison entre les surfaces des pics observés et celles - voisines - des pics donnés par les solutions étalons dans les mêmes conditions opératoires, immédiatement avant ou après l'analyse de l'inconnu.
La surface d'un pic sera déterminée soit en utilisant les données de l'intégrateur disponible, soit par le produit de la hauteur réelle du pic par la largeur mesurée à 54,6 p. 100 de la hauteur totale comptée à partir du sommet.
Après avoir assuré par l'une au moins des méthodes indiquées ici (1 - 2 - 3 (a-b-c-d) - 4) l'identification définitive du résidu, la teneur trouvée sera corrigée après détermination du rendement de la technique par une analyse de l'échantillon additionné avant extraction d'une dose connue - égale ou voisine de celle trouvée - du pesticide incriminé.
La méthode d'extraction utilisée est un compromis entre le désir d'une extraction polyvalente efficace et la nécessité d'un contrôle relativement rapide et peu onéreux. Il est donc parfois nécessaire de préciser le rendement de l'extraction.
Cette détermination ne sera utile que si la teneur trouvée initialement est à la fois inférieure et du même ordre de grandeur qu'une tolérance en vigueur puisque le rendement est normalement supérieur à 80 p. 100 pour les produits stables (organohalogénés en général) et supérieur à 60 p. 100 pour les substances à dégradation plus rapide (organophosphorés en particulier).
Elle ne sera pas indispensable lorsque la teneur trouvée sera supérieure à une tolérance en vigueur, notamment pour les tolérances nulles.
Dans ce dernier cas il convient de considérer que le rendement affecte le seuil de sensibilité de l'analyse.
Identification par chromatographie gazeuse
a) Temps de rétention relatifs :
Le temps de rétention relatif trr du composé à identifier sera déterminé par chromatographie sur colonnes DC 200 et QF 1 en présence d'HHDN, élément de référence.
Les valeurs de trr seront précisées au moment de l'analyse ; les tableaux donnés dans la méthode 6 de l'analyse des vins peuvent être consultés à titre indicatif.
b) Coefficient d'extraction éther de pétrole - acétonitrile "p" :
Ce coefficient "p" peut contribuer à confirmer la présomption de l'identité d'un produit avec un insecticide connu. La technique a été décrite et les valeurs de "p" des principaux insecticides organochlorés indiquées dans l'analyse du vin et de la farine.
c) Analyse par microcoulométrie :
Les éluats E1 et E2 dans lesquels auront été décelés des résidus d'insecticides organochlorés pourront être analysés par chromatographie gazeuse avec détecteur microcoulométrique après concentration suffisante de manière à injecter 20 à 50 microlitres d'une solution titrant au moins 1 mg/l de l'insecticide présumé.
d) Analyse par le détecteur thermoionique
Les éluats E2 et E3 dans lesquels auront été mis en évidence au moyen du détecteur à capture d'électron des résidus apparents d'insecticides organophosphorés pourront être soumis à l'analyse chromatographique avec détecteur thermoionique pour confirmer l'identité de ces composés.
Les éluats E2 et E3 seront analysés directement ou après concentration de manière à soumettre à la chromatographie une solution titrant environ 5 mg/l. Injectez 2 à 4 microlitres.
4° Recherche des insecticides par chromatographie
en couche mince
Les techniques décrites pour la recherche par chromatographie en couche mince des insecticides organochlorés et organothiophosphorés dans le vin peuvent être suivies sans modification (en ce qui concerne la préparation des plaques et la chromatographie) pour rechercher d'éventuels insecticides dans les éluats E1, E2 et E3.
L'éluat E1 ne renferme - dans la limite des produits phytosanitaires essayés jusqu'ici - que des insecticides organochlorés et le soufre.
Les éluats E2 et E3 peuvent contenir des insecticides organohalogénés et organophosphorés.
Recherche des insecticides organohalogénés
L'extraction et la purification des extraits ayant été exécutés comme il vient d'être indiqué ci-dessus, la totalité ou une partie aliquote de l'éluat E1 et la moitié des éluats E2 et E3 pourront être utilisées pour la recherche des insecticides organochlorés par chromatographie en couche mince.
Après avoir évaporé, avec précaution, les fractions choisies - soit E1, E2 et E3, déposez le résidu d'évaporation sur une plaque comme il est indiqué pour l'analyse des vins et continuez en suivant ce même protocole.
Pour l'étude de l'éluat E1, utilisez le mélange éluant à 1 p. 100 de méthanol.
Pour l'étude des éluats E2 et E3, utilisez le mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol.
La présomption de l'identité des taches éventuellement observées sera déduite de la comparaison de leurs Rf avec ceux des insecticides organohalogénés chromatographiés dans les mêmes conditions opératoires.
L'étude des éluats E2 et E3 pourra être exécutée en déposant, d'une part, sur la moitié d'une plaque, des résidus d'éluats concentrés équivalents à 25 g d'échantillon et, d'autre part, sur la deuxième moitié de la même plaque, des résidus de ces mêmes éluats équivalents à 10 g d'échantillon.
Les pesticides organohalogénés (y compris les organophosphorés halogénés) seront recherchés par pulvérisation du réactif de Mitchell sur la première moitié de la plaque tandis que les organothiophosphorés seront révélés par pulvérisation du réactif spécifique indiqué plus loin.
Sensibilité - Une limite de détection aussi élevée que 2 microgrammes (limite qui peut être abaissée) assure le contrôle de l'absence de résidus de pesticides organohalogénés à des teneurs supérieures à 0,08 mg/kg, lors que la recherche est effectuée, comme indiqué, sur l'équivalent de 25 g d'échantillon.
Recherche des insecticides organophosphorés
La recherche des insecticides organothiophosphorés séparés dans les éluats E1 et E2 sera effectuée sur l'équivalent de 10 g d'échantillon (le 1/5 des éluats) comme il vient d'être indiqué ci-dessus).
Révélez les produits organothiophosphorés selon la technique décrite au sujet de l'analyse des vins.
NOTA - La révélation des pesticides organophosphorés possédant un groupement nitré, comme le parathion, peut être assurée très simplement par la pulvérisation d'une solution de potasse alcoolique 2 N.
Les spots jaunes sont accentués après un séjour de 5 mn à l'étuve à 110° et permettent de détecter 0,1 microgramme de parathion.
La présomption de l'identité des taches observées sera déduite par comparaison de leurs Rf avec ceux des pesticides chromatographiés dans les mêmes conditions opératoires.
Sensibilité - Une limite de détection de 0,5 microgramme (limite qui peut être abaissée) assure le contrôle de l'absence de résidus des insecticides indiqués à des teneurs supérieures à 0,05 mg/kg lorsque la recherche est effectuée, comme indiqué, sur l'équivalent de 10 g d'échantillon.
ANNEXE IV
Version en vigueur depuis le 02/12/1968Version en vigueur depuis le 02 décembre 1968
La détermination des résidus d'insecticides organochlorés dans les produits laitiers par chromatographie est sujette à de nombreuses causes d'erreurs qui ne peuvent être surmontées que par l'application parallèle de plusieurs techniques offrant des avantages et des inconvénients.Les trois méthodes décrites ci-dessous offrent les possibilités suivantes :
A. METHODE PAR SAPONIFICATION
Contrôle rapide donnant de bonnes garanties d'identification pour l'HHDN et l'HEOD. Le zeidane est analysé sous forme de son dérivé éthylénique.
La sensibilité est de l'ordre du centième de mg/l pour le lait et du dixième de mg/kg pour le beurre.
B. - METHODE PAR DOUBLE PARTAGE
Contrôle du zeidane et de l'HCH, sensibilité voisine de la méthode A.
C. - METHODE PAR DISTILLATION
Contrôle de l'HCH, de l'HHDN et de l'HEOD pour des teneurs de l'ordre du centième de mg/kg dans le beurre.
A. - Méthode par saponification (HHDN - HEOD - zeidane)
Principe
Les matières grasses du lait et du beurre sont éliminées par saponification avant l'extraction des insecticides. L'extrait brut est purifié par chromatographie sur florisil et l'analyse ensuite réalisée par chromatographie gazeuse.
Matériel
Equipement indiqué dans la méthode I - 6.
Appareil pour la saponification : ballon en verre résistant à la chaleur à fond rond de 100 ml, à col long et rodage 24, surmonté d'un réfrigérant à boules de 30 cm, muni d'un manchon téflon n° 4.
Réactifs
Réactifs a - b - e - f - i et k indiqués dans la méthode I - 6.
l) Solution d'oxalate de potassium à 5 p. 100 dans l'eau distillée lavée ;
m) Potasse alcoolique 2 N - Pesez 15 g de potasse en pastille et dissolvez la dans de l'eau distillée de manière à obtenir 50 ml de solution. Ajoutez 100 ml d'alcool à 95° redistillé. Mélangez.
Introduisez cette solution dans une ampoule à décantation de 250 ml et agitez la avec 30 ml d'éther de pétrole purifié. Laissez reposer et vidangez la phase hydro-alcoolique dans son récipient de stockage.
n) Chlorure de sodium - Maintenir, avant l'emploi, quarante-huit heures au moins dans un four à 180° C.
o) Solution saturée de chlorure de sodium dans l'eau distillée lavée.
p) Acide sulfurique au dixième - Préparez une solution au dixième d'acide sulfurique dans l'eau distillée et lavez ensuite le soluté obtenu par 20 à 25 p. 100 de son volume d'éther de pétrole purifié.
q) Solution de référence :
Préparez par dilutions successives dans l'éther de pétrole des solutions titrées à :
0,25 mg/l d'HHDN ;
0,5 mg/l d'HEOD ;
1,0 mg/l de DDE ;
1,0 mg/l de zeidane.
NOTA - La pureté des réactifs et la qualité du matériel sont deux conditions essentielles pour assurer le bien-fondé des résultats.
Technique
Préparation des extraits destinés à l'analyse chromatographique :
1° Cas du lait :
Saponification :
Dans un ballon en verre résistant à la chaleur de 100 ml, introduisez :
5 ml de lait ;
1 ml de solution aqueuse d'oxalate de potassium ;
20 ml de potasse alcoolique 2 N.
Portez à ébullition sous reflux pendant une heure.
Extraction :
Laissez refroidir, versez dans une ampoule à décantation et ajoutez :
10 ml de solution aqueuse saturée de chlorure de sodium ;
25 ml d'éther de pétrole.
Agitez vigoureusement et laissez reposer avant de soutirer la phase aqueuse. Décantez la phase éthérée dans un bécher. Reversez la phase aqueuse dans l'ampoule et agitez-la modérément avec 25 ml d'éther de pétrole. Après séparation rejetez la phase aqueuse et reversez l'éther de pétrole de la première extraction dans l'ampoule à décantation. Lavez les phases éthérées réunies par 5 ml de solution aqueuse d'acide sulfurique au dixième. Après repos rejetez la phase aqueuse. Lavez à la suite la phase organique trois fois avec 10 ml d'eau distillée lavée.
Chromatographie sur colonne :
Préparez une colonne de florisil-sulfate de sodium de la manière suivante :
Tassez dans la colonne 1,5 à 2 cm de sulfate de sodium anhydre, 5 cm environ (10 g) de florisil et 1,5 à 2 cm de sulfate de sodium anhydre.
Lavez la colonne avec 40 ml de mélange "i" à 20 p. 100 d'éther sulfurique suivis de 50 ml d'éther de pétrole.
Après passage de ces liqueurs qui sont rejetées, introduisez dans la colonne la phase éthérée desséchée et réduite à 10 ml environ au bain-marie et sous jet d'air froid. Eluez successivement au moyen de :
100 ml d'éther de pétrole purifié (E1) ;
40 ml de mélange éluant (E2).
Recueillez séparément les deux éluats (E1) et (E2).
2° Cas du beurre :
Les opérations décrites pour l'analyse du lait sont effectuées en utilisant les quantités suivantes :
Saponification :
0,5 g de beurre ;
10 ml de potasse alcoolique 2 N.
Portez l'ébullition sous reflux pendant une heure.
Extraction :
Laissez refroidir, versez dans une ampoule à décantation et ajoutez :
4 ml d'eau distillée lavée ;
6 ml de solution aqueuse saturée de chlorure de sodium ;
25 ml d'éther de pétrole.
Les opérations ultérieures sont identiques à celles décrites au sujet de l'analyse du lait.
Analyse des extraits par chromatographie gazeuse
L'HHDN et l'HEOD résistent parfaitement à l'hydrolyse alcaline. Le zeidane est quantitativement décomposé en DDE qui résiste.
Le premier éluat E1 permet d'isoler quantitativement l'HHDN et le DDE (isomères op' et pp' existant dans le lait et formés par hydrolyse du zeidane) éventuels.
L'HEOD est obtenue seule dans l'éluat E2.
Recherche et dosage de l'HHDN et du DDE (Eluat E1)
Ajoutez 0,5 ml de solution "k" en premier éluat E1 et concentrez le sous-vide à 2 ml.
Effectuez l'analyse par chromatographie gazeuse dans les conditions habituelles (par exemple à 190° avec la phase DC 200 et à 175° avec la phase QF 1) à partir d'une injection de 2 microlitres d'extrait concentré à 2 ml : quantité équivalente à 5 microlitres de lait ou 0,5 mg de beurre.
Si un résidu d'HHDN ou de DDE est identifié par l'analyse chromatographique sur les deux colonnes DC 200 et QF 1, calculez sa concentration dans le lait ou le beurre après comparaison des surfaces des pics avec celles des pics donnés dans les conditions opératoires précises du moment par des quantités voisines de substances de référence.
Les surfaces seront déterminées soit d'après les données de l'intégrateur, soit par le produit de la hauteur réelle du pic par sa largeur mesurée à 54,6 p. 100 de la hauteur totale comptée à partir du sommet.
Il ne sera pas tenu compte de pics ne dépassant pas 10 p. 100 de l'échelle de l'enregistreur, pics pouvant être donnés - avec un détecteur de sensibilité moyenne - par environ 0,05 ng d'HHDN et 0,1 ng de DDE. Cette restriction limite la sensibilité de la méthode à :
0,01 mg/l d'HHDN ;
0,02 mg/l de DDE dans le lait, et à des quantités dix fois plus élevées dans le beurre (0,9 partie de DDE correspond 1,0 partie de zeidane).
Les résidus d'insecticides peuvent être identifiés en première approximation par l'examen de leurs temps de rétention par rapport à celui de l'HHDN. Ces valeurs - données à titre indicatif seulement dans la méthode I - 6 - varient légèrement avec des conditions opératoires et devront être précisées au moment de chaque analyse.
Recherche et dosage de l'HEOD (Eluat E2)
L'HEOD éventuelle serait éluée en totalité par les 40 ml de mélange éluant "i" à 20 p. 100 d'éther sulfurique.
L'éluat, additionné de 0,5 ml de solution "k" est concentré à 2 ml au bain-marie sous jet d'air froid.
Les injections sont réalisées avec 2 microlitres d'extrait dans chacune des deux colonnes QF 1 et DC 200.
Comme précédemment, il ne sera pas tenu compte des pics ne dépassant pas 10 p. 100 de l'échelle de l'enregistreur, pics pouvant être donnés normalement par 0,1 ng de HEOD (toujours avec un détecteur de sensibilité moyenne).
Ces restrictions limitent la sensibilité de la méthode à 0,02 mg/l de HEOD dans le lait et 0,2 mg/kg dans le beurre.
B. - Méthode par double partage (HCH - zeidane)
Principe
Les insecticides organochlorés extraits avec la matière grasse du produit laitier sont isolés en solution éthérée par un double partage entre l'acétonitrile et l'éther de pétrole suivi d'une élution sélective sur colonne de florisil. L'analyse est ensuite réalisée par chromatographie gazeuse.
Matériel et réactifs
Déjà cités au sujet de la première méthode, à l'exception de :
c) Acétonitrile fraîchement redistillée sur quelques gouttes d'acide phosphorique ;
r) Acétonitrile et éther de pétrole en saturation réciproque. Agitez dans une ampoule à décantation 50 ml de chacun des solvants.
Après repos, soutirez la phase acétonitrile saturée d'éther de pétrole ;
s) Alcool à 95° redistillé sur potasse.
Technique
Préparation des extraits destinés à l'analyse chromatographique :
1° Cas du lait :
Dans une ampoule à décantation de 125 ml, introduisez :
25 ml de mélange :
Alcool à 95° : 2 volumes ;
Ether éthylique : 4 volumes ;
Solution aq. d'oxalate de potassium à 5 p. 100 :
0,1 volume.
5 ml de lait.
Agitez, laissez reposer et ajoutez :
10 ml d'eau distillée ;
30 ml d'éther de pétrole redistillé.
Agitez 2 mn, laissez reposer.
Séparez la phase inférieure. Décantez la phase éthérée dans un petit bécher de 50 ml en la filtrant sur un tampon de laine de verre.
Rincez deux fois l'ampoule à décantation et le coton avec 5 ml d'éther de pétrole.
Evaporez juste à sec au bain-marie en s'aidant d'un jet d'air froid.
Reprenez le résidu par 10 ml d'éther de pétrole saturé d'acétonitrile.
Dans une ampoule de 125 ml épuisez trois fois cette solution avec 10 ml d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole. Les trois phases acétonitrile sont successivement versées et agitées dans une ampoule de 250 ml contenant 150 ml d'eau distillée lavée, 5 ml de solution saturée de NaCl et 30 ml d'éther de pétrole.
La phase éthérée lavée par agitation avec 10 ml d'eau distillée et desséchée ensuite sur sulfate de sodium anhydre, est versée dans une colonne florisil-sulfate de sodium préparée et lavée comme il a été indiqué précédemment.
La phase aqueuse est épuisée avec 10 ml d'éther de pétrole qui, après séparation, lavage à l'eau et déshydratation, sont introduits à la suite dans la colonne de florisil.
Poursuivez l'élution en ajoutant 100 ml d'éther de pétrole dans la colonne. Concentrez l'éluat E1 à 2 ml en présence de 0,5 ml de solution k.
1 ml d'extrait purifié équivaut à 2,5 ml de lait.
2° Cas du beurre :
Dans un bécher de 100 ml, pesez exactement 1 g de beurre. Dissolvez-le dans un mélange d'alcool à 95° + éther sulfurique (1 + 2), transvasez la solution dans un ballon jaugé de 100 ml et complétez au trait de jauge en rinçant le bécher avec le même mélange. Agitez.
Dans une ampoule à décantation de 125 ml introduisez :
1 ml de solution aqueuse d'oxalate de potassium à 5 p. 100 ;
25 ml de la solution éthéro-alcoolique de beurre (soit 0,25 g de beurre) ;
30 ml d'éther de pétrole.
Agitez et ajoutez ensuite : 25 ml d'eau distillée. Agitez vigoureusement et laissez reposer avant de soutirer la phase aqueuse.
Décantez la phase éthérée dans un vase renfermant du sulfate de sodium anhydre et de ce vase dans un bécher de 50 ml.
Reversez la phase aqueuse dans l'ampoule et agitez-la modérément avec 25 ml d'éther de pétrole qui sera ajouté au premier extrait.
Evaporez juste à sec l'extrait éthéré et reprenez-le avec 10 ml d'éther de pétrole saturé d'acétonitrile.
Continuez en suivant la technique décrite pour l'analyse du lait à partir de : "Dans une ampoule de 125 ml épuisez trois fois cette solution avec 10 ml d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole ...".
Concentrez également à 2 ml l'éluat E1 en présence de 0,5 ml de solution "k".
1 ml d'extrait purifié équivaut à 0,125 g de beurre.
Analyse des extraits par chromatographie gazeuse
Injectez sur colonne DC 200 et QF1 2 microlitres des solutions de référence d'HCH et de zeidane pour contrôler la sensibilité et les temps de rétention des insecticides recherchés.
Injectez 4 microlitres d'extrait purifié E1 concentré à 2 ml.
Les résultats sur les deux colonnes devront être concordants.
Il ne sera pas tenu compte des pics inférieurs à 10 p. 100 de l'échelle de l'enregistreur, soit généralement moins de 0,05 ng d'HCH technique et 0,2 ng de zeidane.
Ces conditions limitent la sensibilité de la méthode pour le lait à 0,005 mg/l de HCH et 0,02 mg/l de zeidane, et pour le beurre à 0,1 mg/kg de HCH et 0,4 mg/kg de zeidane.
Lorsque l'analyse du beurre est négative, l'extrait pourra être concentré à 0,50 ml de manière à abaisser le seuil de sensibilité de l'analyse.
NOTA - Les deux techniques ci-dessus : méthode par saponification et méthode par double partage ont été étudiées en fonction de limites déterminées de sensibilité d'un appareillage particulier dans ses conditions moyennes de travail. Si un détecteur plus sensible est utilisé, la concentration des éluats sera réduite proportionnellement à l'augmentation de sensibilité du nouveau détecteur de manière à conserver les seuils indiqués ici.
C - Méthode par distillation extractive (HCH - HHDN - HEOD)
Principe
Les insecticides sont entraînés par la vapeur d'eau surchauffée par une solution glycérinée du beurre ou du lait. Après distillation d'un mélange d'éther de pétrole et d'octane, le distillat est épuisé par ces mêmes hydrocarbures maintenus à la température ordinaire par un réfrigérant.
Après élution sélective sur colonne florisil, les éluats sont analysés par chromatographie gazeuse avec détecteur à capture d'électron.
Matériel particulier
- appareil de DEAN et STARK pour distillation extractive avec solvant plus léger que l'eau et dont le réservoir récepteur est équipé d'un réfrigérant.
Réactifs
Réactifs a - b - e - f de la méthode I - 6.
t) Glycérine bidistillée R. P. d = 1,26.
u) Octane E. K. P. 1107 Eb : 125''8.
Mode opératoire
Distillation extractive :
Dans le ballon de 250 ml de l'appareil à distiller pesez exactement :
5 g de beurre,
Ajoutez exactement :
40 ml de glycérine ;
5 ml d'eau distillée ;
5 ml d'octane ;
15 ml d'éther de pétrole,
Et quelques billes de verre.
Introduisez dans l'appareil récepteur v ml d'eau distillée, volume préalablement déterminé comme suit :
L'appareil étant séparé du ballon à distillation, garnissez-le complètement d'eau distillée, introduisez ensuite au-dessus de l'eau 20 ml d'éther de pétrole et laissez l'équilibre s'établir librement. Vidangez ensuite l'eau restant au-dessous de l'éther et dans la tubulure de retour et notez son volume v ml.
Ce volume variera avec la capacité particulière de chaque appareil (12 à 20 ml).
Adaptez le ballon sous le récepteur. Distillez pendant deux heures.
Pour l'analyse du lait, introduisez les mêmes quantités de réactifs avec 10 ml de lait dans le ballon et (v - 5) ml d'eau distillée dans le récepteur.
Séparation chromatographique :
Après arrêt de la distillation soutirez le contenu de l'extracteur dans une ampoule à décantation de 125 ml. Séparez la phase aqueuse, décantez la phase éthérée dans un bécher de 100 ml renfermant 5 g de sulfate de sodium anhydre et de celui-ci dans la colonne de florisil-sulfate de sodium préparée comme il a été indiqué précédemment.
Rincez le réfrigérant et l'appareil extracteur avec 20 ml d'éther de pétrole qui sera reçu successivement dans l'ampoule, le bécher et la colonne à la suite de l'extrait précédent.
Après disparition des solutions éthérées dans la colonne continuez l'élution avec 65 ml d'éther de pétrole de manière à recueillir dans un ballon jaugé 100 ml d'éluat, soit E1 cet éluat.
Eluez ensuite avec 40 ml de mélange "i" à 20 p. 100 d'éther sulfurique dans l'éther de pétrole, soit E2 cet éluat.
Analyse des éluats par chromatographie gazeuse
a) Eluat E1 - Recherche et dosage de l'HCH et de l'HHDN :
L'éluat E1 renferme la totalité des résidus éventuels de HCH et d'HHDN quantitativement extraits du lait ou du beurre.
Il peut renfermer en partie (30 p. 100 environ) le zeidane du produit laitier.
En raison des variations des teneurs en insecticides dans le beurre et des limites étroites de la gamme de mesure du détecteur à capture d'électron, le choix de la meilleure concentration de l'éluat est difficilement prévisible.
Une première détermination avec 4 microlitres d'éluat E1 non concentré sera effectuée avant de procéder à la concentration de l'extrait à 10 ml dans le cas du beurre (ou 5 ml dans le cas du lait).
L'évaporation peut être réalisée au bain-marie sous jet d'air froid et filtré et après addition de 0,5 ml de solution "k" à 1 p. 100 d'huile de paraffine. Elle sera effectuée dans un bécher au début et ensuite dans un tube conique gradué de 15 ml avec les précautions d'usage.
En fonction du volume final de l'éluat représentant 5 g de beurre ou 10 ml de lait, l'injection de 4 microlitres d'extrait permet le contrôle des teneurs en HCH et HHDN indiquées au tableau I. Dans chaque cas les valeurs des limites peuvent être multipliées par quatre en réduisant le volume injecté de 4 à 1 microlitres.
TABLEAU n° 1
Teneurs en HCH ou en HHDN contrôlées correctement avec un détecteur de sensibilité moyenne (gamme de mesure : 0,05 à 0,20 ng) après injection de 4 microlitres d'éluat E1, en fonction de la concentration choisie
Les teneurs sont exprimées en mg/kg :
:================================: : CONCENTRATION : : : de l'éluat E1 : 100 ml : : à ... : : :----------------:---------------: : Beurre .. : 0,25 à 1,0 : : : : : Lait .. : 0,12 à 0,50 : : : : :================================: :================================: : CONCENTRATION : : : de l'éluat E1 : 10 ml : : à ... : : :----------------:---------------: : Beurre .. : 0,02 à 0,10 : : : : : Lait .. : 0,01 à 0,05 : : : : :================================: :================================: : CONCENTRATION : : : de l'éluat E1 : 5 ml : : à ... : : :----------------:---------------: : Beurre .. : 0,01 à 0,05 : : : : : Lait .. : 0,005 à 0,025 : : : : :================================: L'analyse chromatographique est réalisée dans les conditions habituelles. b) Eluat E2 - Recherche et dosage de l'HEOD :
L'HEOD éventuelle serait éluée en totalité par les 40 ml du mélange éluant "i".
L'éluat, additionné de 0,5 ml de solution "k", est concentré à 5 ml au bain-marie sous jet d'air froid, pour les analyses de routine.
Les injections sont réalisées avec 4 microlitres d'extrait E2 concentré à 5 ml dans chacune des deux colonnes DC 200 et QF 1.
Une gamme de mesures comprise entre 0,1 et 2 ng permet un dosage correct des résidus de HEOD entre :
0,02 et 0,4 mg/kg d'HEOD dans le beurre
ou 0,01 et 0,2 mg/l d'HEOD dans le lait.
Si la chromatographie de l'éluat E2, comprend divers pics dont l'un est assimilable à celui de l'HEOD, à défaut de contrôle par microcoulométrie, une purification complémentaire analogue à celle de la méthode A sera exécutée comme suit :
Introduisez l'éluat E2, déjà concentré à 5 ml dans un tube gradué, dans un ballon à fond rond de 100 ml muni d'un rodage permettant de l'adapter à un réfrigérant ascendant.
Rincez le tube avec 2 ml d'éther de pétrole suivis de 10 ml de potasse alcoolique 2 N.
Portez le mélange à l'ébullition sous reflux pendant 45 mn.
Après refroidissement, versez dans une ampoule à décantation et ajoutez :
10 ml d'eau distillée lavée ;
20 ml d'éther de pétrole.
Agitez vigoureusement et laissez reposer avant de soutirer la phase aqueuse. Décantez la phase éthérée dans un bécher. Reversez la phase aqueuse dans l'ampoule et agitez-la modérément avec 20 ml d'éther de pétrole. Après séparation, rejetez la phase aqueuse et reversez l'éther de pétrole de la première extraction dans l'ampoule à décantation.
Lavez les phases éthérées réunies par 5 ml de solution aqueuse d'acide sulfurique au dixième. Après repos, rejetez la phase aqueuse. Lavez à la suite la phase organique 3 fois avec 10 ml d'eau distillée lavée.
La phase éthérée, séchée sur sulfate de sodium, est concentrée exactement à 10 ml (ou 5 ml) pour l'analyse chromatographique.
Contrôle des résultats
Un premier contrôle qualitatif des résultats obtenus avec le détecteur à capture d'électron a été acquis par l'analyse sur deux colonnes de polarité différente DC 200 et QF 1. Les résultats ont été considérés comme valables lorsque les deux essais sur le même extrait purifié ont donné des valeurs comparables, compte tenu des approximations suivantes acceptables pour l'analyse des traces :
plus ou moins 10 p. 100 entre 1 et 10 mg/kg ;
plus ou moins 20 p. 100 pour 0,1 mg/kg ;
plus ou moins 50 p. 100 pour 0,01 mg/kg ;
plus ou moins 100 p. 100 pour 0,001 mg/kg.
Il convient de ne pas oublier que le détecteur à capture d'électron n'offre pas de garantie de spécificité pour les insecticides organochlorés.
La teneur calculée d'après le signal enregistré donne l'expression, dans la mesure où la méthode est quantitative, d'une concentration limite au-dessus de laquelle l'absence de résidu peut être garantie.
Une deuxième analyse au moyen d'une technique différente devra confirmer un résultat positif.
Le choix de la deuxième méthode à utiliser est schématisé dans le tableau suivant :
:================================: : : METHODE : : : POUR LA : : METHODE : CONFIRMATION : : UTILISEE : DU RESULTAT : : la première :--------------: : : HCH : :-----------------:--------------: : C : B : : : : : A : C : : : : : B : C : : : : :================================: :================================: : : METHODE : : : POUR LA : : METHODE : CONFIRMATION : : UTILISEE : DU RESULTAT : : la première :--------------: : : HHDN : : : HEOD : :-----------------:--------------: : C : A : : : : : A : C : : : : : B : C : : : : :================================: :================================:
: : METHODE : : : POUR LA : : METHODE : CONFIRMATION : : UTILISEE : DU RESULTAT : : la première :--------------: : : Zeidane : :-----------------:--------------: : C : A : : : : : A : B : : : : : B : A : : : : :================================: Le contrôle qualitatif et quantitatif du résultat pourra être effectué par analyse microcoulométrique après chromatographie gazeuse, méthode capable d'assurer un contrôle spécifique des substances organophalogénées (Cl-Br-I). Recherche et dosage des résidus par analyse microcoulométrique
A titre de vérification des résultats positifs obtenus avec le détecteur à capture d'électron, l'analyse microcoulométrique pourra être effectuée à la suite sur les mêmes extraits pratiquement conservés en totalité.
Les extraits purifiés obtenus dans les méthodes décrites ci-dessus peuvent être analysés directement par microcoulométrie au moyen d'un microcoulomètre Dohrmann relié à la sortie d'une colonne pour chromatographie gazeuse. La colonne sera en verre résistant à la chaleur : longueur 1,20 m, diamètre extérieur 6 mm garnie de silicone DC 200 à 10 p. 100 sur chromosorb G 60/80 mesh.
La vérification du résultat au moyen du détecteur microcoulométrique est correcte pour l'HCH, l'HHDN et l'HEOD entre 10 et 100 ng et pour le zeidane entre 40 et 400 ng. Le volume de l'injection sera limité à 50 microlitres, mais il pourra être porté à 100 microlitres si nécessaire.
Il convient donc de concentrer les éluats E1 ou E2 de manière à ce qu'ils titrent au moins entre 0,5 et 1 mg/kg en insecticide recherché.
L'évaporation sera effectuée sous jet d'air froid filtré.
Les éluats renfermant déjà 0,5 ml de solution "k" afin de réduire les pertes par évaporation. Ces pertes sont d'autant plus importantes que l'extrait est mieux purifié et que la concentration est plus poussée. Elles pourront être sensibles pour l'HHDN et surtout l'HCH, le gamma HCH, insecticides pour lesquels l'évaporation à sec est irréalisable sans pertes.
Après concentration à 0,1 ml, par exemple, un résultat inférieur de 10 à 30 p. 100 à celui obtenu avec le détecteur à capture d'électron peut donc être considéré comme normal.
La méthode par distillation extractive, grâce à une prise d'essai plus importante, permet d'éviter une concentration excessive.
Compte tenu de ces conditions, les limites suivantes de détection peuvent être atteintes par microcoulométrie après injection de 100 microlitres d'éluat concentré à 0,20 ml.
A - Méthode par saponification
(prise d'essai de 5 ml de lait ou 0,5 g de beurre)
HHDN et HEOD .. 0,004 mg/l dans le lait ;
0,04 mg/kg dans le beurre.
Zeidane .. 0,016 mg/l dans le lait ;
0,16 mg/kg dans le beurre.
B - Méthode par double partage
(prise d'essai du 5 ml de lait ou 0,25 g de beurre)
HCH .. 0,004 mg/l dans le lait ;
0,08 mg/kg dans le beurre.
Zeidane .. 0,016 mg/l dans le lait ;
0,3 mg/kg dans le beurre.
C - Méthode par distillation extractive
(prise d'essai de 10 ml de lait ou 5 g de beurre)
HCH, HHDN, HEOD .. 0,004 mg/l dans le lait ;
0,04 mg/kg dans le beurre.
Moins sujette à des causes d'erreurs, la méthode microcoulométrique peut être ici appliquée à la recherche de teneurs plus faibles que ne le permet le détecteur à capture d'électron. De telles mesures n'étant pas nécessaires, la concentration des éluats E1 et E2 de cette troisième méthode sera limitée à 2 ml afin d'assurer une meilleure analyse quantitative.
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