L'extraction des pesticides est réalisée par le benzène. Après évaporation de l'extrait, le résidu est chromatographié sur plaque imprégnée de gel de silice G. Merck, lavée à l'eau distillée avant activation. L'élution est effectuée au moyen d'éther de pétrole à 7 p. 100 de méthanol. Les spots sont révélés au moyen de réactifs spécifiques des thiophosphates organiques.

Des quantités de l'ordre de 0,5 microgramme d'insecticide organothiophosphoré sont détectées en présence de l'extrait de 50 ml de vin, permettant à la méthode de révéler des teneurs en insecticides thiophosphorés supérieures à 0,01 mg/l.

MATERIEL

Identique à celui de la méthode 4.

REACTIFS

Réactifs : a - b - d - e - f - h2 de la méthode 4.

i) Ether sulfurique fraîchement redistillé.

j) Réactifs pour la révélation des chromatogrammes :

Solution A :

Ester éthylique de la tétrabromophénolphtaléine (E. Kodak n° 6810) ... 0,10 g

Acétone ... 50 ml

Solution B :

Nitrate d'argent ... 0,05 g

Eau distillée ... 25 ml

Dissoudre le sel et diluer à 100 ml avec de l'acétone distillée.

Solution C :

Acide citrique ... 5 g

Eau distillée ... 50 ml

Dissoudre l'acide dans l'eau et diluer à 100 ml avec de l'acétone distillée.

PREPARATION DES PLAQUES

Suivez la technique indiquée dans la méthode 4.

TECHNIQUE

Extraction

Introduisez successivement dans une ampoule de décantation :

50 ml de vin ou de jus de raisin.

10 g environ de sulfate de sodium cristallisé.

50 ml de benzène.

Agitez modérément pendant 5 à 10 minutes. Après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, ou éventuellement une centrifugation, vidangez la phase inférieure dans une deuxième ampoule de décantation.

Lavez le benzène par agitation légère avec 20 ml d'eau distillée.

Ajoutez 50 ml de benzène dans la deuxième ampoule, agitez et laissez reposer.

Rejetez la phase inférieure de la deuxième ampoule, vidangez dans cette ampoule l'eau de lavage de la première ampoule, agitez et rejetez cette eau. Lavez une deuxième fois le benzène de la première ampoule avec 10 ml d'eau distillée qui est ensuite utilisée pour laver le benzène de la deuxième ampoule.

Transvasez les phases benzéniques dans un bécher sec et de celui-ci dans un ballon de 100 ml de l'évaporateur rotatif (en deux temps). Evaporez juste à sec avec l'aide du vide et d'un léger réchauffement du ballon (50° C environ).

Chromatographie

Dépôt des spots

Rincez les parois intérieures du ballon de l'évaporateur avec plusieurs petits volumes d'éther sulfurique, de manière à transposer la totalité du résidu dans un petit bécher (50 ml au maximum) ; évaporez l'éther sous jet d'air froid, lavez les parois du bécher avec un minimum d'éther de pétrole et déposez entièrement cette dernière solution sur la plaque. Plusieurs reprises à l'éther de pétrole sont nécessaires pour que le dépôt soit quantitatif.

Des solutions titrées de référence seront toujours disposées sur chaque plaque pour contrôler la sensibilité et identifier éventuellement les produits décelés.

5 microlitres de solution de référence contenant respectivement 0,5 g par litre (dans l'éther de pétrole) de chacun des insecticides dont on désire contrôler la présence, pourront être disposés, soit séparément, soit simultanément en utilisant par exemple le mélange suivant :

Azinphos - malathion - parathion-méthyl - fénitrothion - parathion.

La dernière position sera occupée par 4 microlitres du mélange de colorants Desaga.

Ce mélange devra être séparé :

Le rouge Soudan G migre avec un Rf voisin de 0,53 ;

L'indophénol migre avec un Rf voisin de 0,56 ;

Le jaune beurre avec un Rf voisin de 0,88.

Elution

La plaque est introduite dans la petite cuve pour chromatographie en couche mince dont l'atmosphère est saturée par l'introduction préalable de mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol dans l'éther de pétrole redistillée.

La hauteur de solvant dans lequel trempe la plaque ne doit pas dépasser 0,5 cm. La chromatographie dure ainsi environ quarante-cinq minutes pour un déplacement du front au-dessus de la ligne de départ des spots de 10-11 cm environ.

Notez la position du front dès la sortie des plaques de la cuve.

NOTA - La migration des colorants renseigne sur la qualité de la séparation qui dépend en particulier de l'état de saturation de l'enceinte de la cuve et par suite de la température ambiante. Il est possible que l'opérateur soit amené à faire varier entre 6 et 8 p. 100 la concentration en méthanol pour tenir compte des conditions locales de température. Une enceinte thermostatique serait souhaitable.

Révélation des insecticides organothiophosphorés.

Le réactif j est spécifique des esters thiophosphoriques, l'intensité de la coloration variant avec la position du soufre dans la molécule. Il ne réagit pas avec les esters phosphoriques comme le mévinphos ne renfermant pas de soufre, et malgré la présence de nitrate d'argent, ne donne rien avec les insecticides organochlorés dans les conditions de son emploi.

Après évaporation du solvant, pulvérisez successivement sur toute la surface de la plaque, au moyen de trois pulvérisateurs garnis au préalable des réactifs A, B et C ;

1° Le réactif A : indicateur coloré ;

2° Le réactif B : nitrate d'argent ;

3° Le réactif C : acide citrique ;

Les extraits de 50 ml de vin, qui laissaient apparaître une légère traînée jusqu'au Rf 0,2 environ, avant la pulvérisation des réactifs, ne donnent plus aucune tache après pulvérisation des réactifs.

Les colorants du mélange d'essai virent, à l'exception du rouge (qui le demeure) : au rouge pour le jaune beurre, au jaune pour le bleu qui disparaît ainsi dans le fond jaune.

Les composés organo-thiophosphorés apparaissent en bleu vif sur fond jaune uni. La teinte bleu vif reste intacte pendant vingt à trente minutes, disparaît par la suite, mais laisse une trace encore perceptible après 24 heures.

Les tâches sont très apparentes au-dessus de 1 microgramme. 0,5 microgramme constitue une limite moyenne raisonnable pour la perception, mais il est indiqué de chromatographier en même temps que les extraits du vin, l'insecticide ou les insecticides dont on désire vérifier l'absence.

Cette assurance étant prise, l'absence de tache bleue dans la chromatographie d'un extrait de 50 ml de boisson indique que le produit examiné renferme moins de 0,01 mg/l desdits insecticides organothiophosphorés.

L'identité des insecticides organo-thiophosphorés éventuellement observés sera déduite par comparaison de leurs Rf par rapport à ceux des témoins obtenus dans le même essai.

Les valeurs suivantes des Rf, qui ne sont modifiés en présence de l'extrait du vin, ont été notées :

Tableau 1 - Rf des insecticides organo-phosphorés sur Silicagel G. Merck (élution méthanol 7 p. 100) :

Azinphos méthyl ... 0,21

Malathion ... 0,45

Phosalone ... 0,50

Parathion-méthyl ... 0,56

Fénitrothion ... 0,62

Diazinon ... 0,63

Phenthoate ... 0,68

Parathion ... 0,70

Bromophos ... 0,75

Fenthion ... 0,78

Carbophénothion ... 0,76

Notes :

1° Recherche de parathion :

La révélation des pesticides organophosphorés possédant un groupement nitré, comme le parathion, peut être assurée très simplement par la pulvérisation d'une solution de potasse alcoolique 2 N.

Les spots jaunes sont accentués après un séjour de cinq minutes à l'étuve à 110° et permettent de détecter 0,1 microgramme de parathion.

Si"cette recherche est effectuée sur le cinquième de l'extrait benzénique, soit l'équivalent de 10 ml de boisson, elle assure le contrôle de l'absence de résidus de parathion à une teneur supérieure à 0,01 mg/l.

2° Recherches après élution sur Florisil :

Lorsque l'analyse par chromatographie en couche mince sera appliquée à l'étude des éluats donnés par le fractionnement sur Florisil, il sera inutile de procéder à l'étude de l'Eluat E, qui ne renferme pas d'insecticides organophosphorés. Seuls les éluats E2 et E3 devront, dans ce cas, être étudiés.