L'extraction du dinocap (dinitro capryl phényl crotonate) est réalisée par l'éther de pétrole. Le dosage colorimétrique est effectué directement sur l'extrait concentré au moyen de pyridine. La recherche et le dosage peuvent être effectués sur un extrait purifié par chromatographie sur florisil au moyen de la chromatographie gazeuse avec détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène.

Le dosage colorimétrique, possible entre 10 et 100 microgrammes de dinocap, permet de déceler et de doser ce fongicide à des teneurs comprises entre 0,1 et 1 mg/l à partir de 100 ml de boisson.

Le dosage par chromatographie gazeuse, possible à partir de 0,2 microgrammes permet l'identification et le dosage de doses supérieures à 0,05 mg/l dans de bonnes conditions opératoires.

MATERIEL

Ampoules à décantation de 250 ml.

Evaporateur rotatif sous vide.

Spectrophotomètre pour mesures dans le visible.

Colonne à chromatographie (diamètre : 2 cm ; hauteur : 60 cm).

Chromatographe à détecteur à ionisation de flamme.

REACTIFS

a) Ether de pétrole 40-65° redistillé.

b) Sulfate de sodium anhydre.

c) Ether sulfurique fraîchement redistillé.

d) Florisil 60/100, activé par séjour à l'étuve à 130° pendant vingt-quatre heures, puis additionné de 5 p. 100 d'eau

distillée, conservé en flacon bouché et utilisé à partir de vingt-quatre heures de repos.

e) Pyridine anhydre redistillée additionnée de 1 p. 100 d'eau distillée.

f) Solutions de référence :

A - Mère : à 200 mg par litre. Dissoudre 50 mg de dinocap dans 250 ml d'éther de pétrole.

B - Solution à 20 mg par litre. Diluer au dixième la solution mère avec de l'éther de pétrole.

MODE OPERATOIRE

Extraction

Dans une ampoule à décantation de 250 ml, introduisez :

100 ml de vin ou de jus de raisin ;

75 ml d'éther de pétrole.

Agitez pendant cinq à dix minutes. Après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, vidangez la phase inférieure dans une deuxième ampoule à décantation.

Lavez l'éther de pétrole par agitation légère avec 20 ml d'eau distillée.

Ajoutez 50 ml d'éther de pétrole dans la deuxième ampoule, agitez et laissez reposer.

Rejetez la phase aqueuse de la deuxième ampoule, vidangez dans cette ampoule l'eau de lavage de la première ampoule, agitez et rejetez cette eau. Lavez une deuxième fois l'éther de pétrole de la première ampoule avec 5 à 10 ml d'eau distillée qui est encore utilisée pour laver l'éther de la deuxième ampoule.

Réunissez les deux phases éthérées dans un bécher sec, desséchez avec 5 g environ de sulfate de sodium anhydre et transvasez la solution dans un évaporateur rotatif, rincez les ampoules et le bécher avec un petit volume d'éther de pétrole qui est également introduit dans le ballon de l'évaporateur.

Si l'on dispose de ballons de 100 ml et d'un évaporateur permettant une évaporation avec alimentation progressive de ces ballons, évaporez sans atteindre la siccité : 2 à 3 ml devant subsister pour éviter les pertes.

Si l'évaporation est réalisée dans un ballon de plus grande capacité, évaporez également jusqu'à ce qu'il ne subsiste plus que quelques ml, mais pas à sec. Egouttez dans un petit bécher de 50 ml, rincez les parois du ballon avec quelques ml d'éther de pétrole anhydre, à plusieurs reprises ; évaporez l'éther sous jet d'air froid en laissant subsister de 1 à 3 ml de liquide dans le petit bécher.

Recherche et dosage

1° Colorimétrie

Dans le bécher de 50 ml renfermant l'extrait concentré, ou bien dans le petit ballon de 100 ml à large col de l'évaporateur renfermant l'extrait concentré, ajoutez 3 ml de pyridine à 1 % d'eau.

Abandonnez sous une hotte le récipient non bouché pendant une heure. Mesurez ensuite l'intensité de la coloration jaune développée par rapport à la pyridine à 1 p. 100 d'eau, à 442 nm et dans des cuves de 1cm d'épaisseur.

Etalonnage

La courbe d'étalonnage sera précisée par la mesure des densités optiques des teintes obtenues après 1 h de repos, par mélange de :

0,5, 1,0, 2,0 et 4,0 ml de solution de référence b, soit : 10, 20, 40 et 80 microgrammes de dinocap avec 3 ml de réactif pyridine à 1 p. 100 d'eau.

Remarque - L'introduction du réactif pyridine-eau dans l'extrait éthéré concentré et non sur le résidu sec d'évaporation de cet extrait évite les risques réels de pertes de l'évaporation totale de l'extrait. L'hydrolyse s'effectue normalement dans ce milieu, tandis que l'excès d'éther s'évapore spontanément à l'air libre dans le petit récipient débouché. La hotte est indiquée pour éviter de répandre dans le laboratoire l'odeur désagréable de la pyridine. Le volume final de 3 ml pourra être vérifié par simple pesée du bécher préalablement taré, la densité étant pratiquement égale à 1. Lorsque la coloration est développée, un excès d'éther de pétrole peut être éliminé sans risques de pertes par évaporation forcée sous jet d'air froid, ce qui autorise toute opération jugée utile ; pour transvaser le contenu du récipient : bécher ou ballon, dans un tube gradué, rincer avec de l'éther de pétrole et amener à 3 ml par évaporation. Ces opérations ne sont cependant pas nécessaires.

Rendement

L'étude des vins surchargés de dinocap immédiatement avant leur analyse par la méthode ci-dessus a montré que le fongicide introduit est retrouvé avec un rendement de 90 à 95 p. 100.

2° Chromatographie gazeuse

L'extrait concentré précédemment obtenu peut être utilisé pour rechercher et doser le dinocap par chromatographie gazeuse. Lorsque cette détermination, qui nécessite l'emploi de moins de 10 p. 100 de l'extrait, sera envisagée, elle pourra être effectuée avant de procéder au dosage colorimétrique sur le reste de l'extrait.

L'extrait concentré sera au préalable et en totalité purifié comme suit.

Purification

a) Préparation de la colonne :

Dans la colonne à chromatographie 20 X 600 mm, tassez successivement :

2,5 cm de sulfate de sodium anhydre.

5 cm de florisil (10 g).

1,5 cm de sulfate de sodium anhydre.

b) Mélange éluant :

Ether sulfurique fraîchement redistillé ... 20 ml.

Ether de pétrole 40-65° redistillé ... 80 ml.

c) Opération :

Lavez au préalable le contenu de la colonne par 40 ml de mélange éluant.

Introduisez ensuite le concentré de l'extrait éthéré dans la colonne, rincez le récipient et les parois de la colonne avec de petits volumes de mélange éluant, de manière à parfaitement reprendre la totalité de l'extrait. Utilisez 75 ml de mélange éluant.

L'éluat sera ensuite évaporé, sous vide, ou bien au bain-marie sous jet d'air froid, dans un petit ballon ou un bécher de 50 ml, en prenant soin de ne pas arriver à siccité. Il sera enfin concentré exactement à 0,5 ml dans un tube gradué conique :

0,45 ml pourront être utilisés pour le dosage colorimétrique.

0,05 ml serviront au dosage chromatographique.

d) Conditions de travail pour la chromatographie gazeuse :

Colonne : tube en verre résistant à la chaleur 5' 1/8'' garnie de DC 200 à 10 p. 100 sur Chromosorb W HMDS 80/100.

Température de la colonne : la température constante peut être prise entre 205 et 210°.

Température de l'injecteur : 190 à 210°.

Débit d'azote : 40 ml par mn.

Pression à l'entrée de l'appareil : 2,0 kg par cm2.

Détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène.

Sensibilité : à l'atténuation 1/40, le détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène permet le tracé de chromatogrammes avec des quantités de dinocap comprises entre 0,2 et 0,8 microgramme.

Solution de référence : la solution-mère renfermant 0,2 microgrammes de dinocap par microlitre convient aux essais témoins.

Dans les conditions indiquées ici, le dinocap donne un pic composite formé de trois pics non séparés, dont les temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN sont voisins de 5,55, 6,0 et 7,15.

Dans les conditions indiquées, le dinocap est entièrement élué en moins de 20 mn.

Ces temps de rétention relatifs seront toujours vérifiés dans les conditions particulières de chacun.

e) Recherche et dosage dans l'échantillon :

Les essais seront effectués par injections de 1 à 4 microlitres de l'extrait concentré à 0,5 ml.

L'absence de pics aux temps de rétention où est élué le dinocap peut être considérée comme l'indication de l'absence de ce produit à une dose supérieure à 0,2 microgramme dans l'essai, soit une teneur supérieure à 0,25 mg/l pour une injection de 4 microlitres de l'extrait de 100 ml de boisson concentré à 0,5 ml.

La sensibilité peut être amenée à 0,05 mg/l après concentration de l'extrait à 0,10 ml dans le tube conique gradué.

Si cette dernière détermination est jugée utile par suite de la teneur faible ou nulle de dinocap dans la boisson analysée, l'opération peut disposer de la totalité de l'extrait pour les essais chromatographiques, puisque le dosage colorimétrique a perdu son intérêt par sa sensibilité trop faible.

Le calcul du résultat sera fait comme dans tout dosage chromatographique, par comparaison entre les surfaces observées :

échantillon et étalonnages.