L'extraction des pesticides est réalisée par l'éther de pétrole. Après évaporation de l'extrait, le résidu est chromatographié sur plaque imprégnée de gel de silice G. Merck lavée à l'eau distillée avant activation. L'élution est effectuée au moyen du mélange éther de pétrole et méthanol. Les spots sont révélés par irradiation de lumière ultra-violette à 254 microns de grammes des plaques traitées au réactif de Mitchell. Des quantités de l'ordre de 2 microgrammes de pesticides organo-halogénés peuvent être détectées très nettement, permettant à la présente méthode de révéler des doses d'insecticides organohalogénés à des doses supérieures de 0,1 mg/l avec des prises d'essai de 25 ml de vin ou de jus de raisin.

MATERIEL

Ampoules à décantation de 250 ml.

Evaporateur rotatif ou bain-marie avec soufflerie d'air froid.

Dispositif pour chromatographie en couche mince (le matériel Desaga a été utilisé).

Cuve 36 X 28 X 26 cm (de chromatographie sur papier).

Etuve.

Lampe U-V émettrice de radiations à 254 et 360 microgrammes.

REACTIFS

a) Ether de pétrole 40-65° redistillé.

b) Alcool méthylique redistillé sur potasse.

c) Acétone redistillée.

d) Sulfate de sodium cristallisé pur.

e) Gel de silice G. de Merck.

f) Mélange colorant d'essai de Desaga.

g) Réactif de révélation de Mitchell.

Dissoudre 1,7 g de nitrate d'argent dans 5 ml d'eau distillée ; ajouter 10 ml de 2-phénoxyéthanol et compléter à 200 ml avec de l'acétone. Ajouter deux gouttes d'eau oxygénée à 30 p. 100. Conserver le réactif à l'abri de la lumière et dans un flacon en verre coloré. Conservation quinze jours au maximum.

h) Mélange éluant :

h1) Ether de pétrole 40-65° redistillé, additionné de 1 p. 100 de méthanol redistillé sur potasse.

h2) Ether de pétrole à 7 p. 100 de méthanol.

k) Solution "k" : huile de paraffine à 1 p. 100 dans l'éther de pétrole.

PREPARATION DES PLAQUES

L'étalement des couches est obtenu avec le matériel Desaga Standard, en utilisant un mélange de :

25 g de gel de silice G ;

50 ml d'eau distillée,

immédiatement étalé sur plaques de verre 20 X 20 cm.

Les plaques obtenues sont séchées douze heures environ à l'air du laboratoire, dans une atmosphère à l'abri des vapeurs d'acide chlorhydrique.

Les plaques sèches sont ensuite lavées soigneusement à l'eau distillée. A cette fin, elles sont disposées dans une cuve à chromatographie renfermant une couche de 1 cm d'eau distillée. Une épaisse couche de papier filtre sec est placé au-dessus des plaques, au contact de celles-ci, de manière à absorber l'eau lorsqu'elle a parcouru toute la longueur de la plaque.

La cuve est fermée et l'ensemble est abandonné quatre heures au moins, ou mieux une nuit. Après ce lavage continu à l'eau distillée, les plaques sont abandonnées à l'air pour un séchage progressif (une à deux heures), et ensuite portées exactement une heure à l'étuve à 110° C.

Après refroidissement dans l'exsiccateur Novus, les plaques sont prêtes à l'emploi.

La migration de l'eau ayant été réalisée dans le sens de l'étalement de la couche, une bande de 1 cm environ, baignant dans l'eau, s'est désagrégée pendant le lavage. Afin d'éviter l'utilisation d'une trop grande quantité de solvant éluant, les spots seront disposés à 5 cm du bord opposé, la migration des spots devant s'effectuer dans le sens inverse de celui de la migration de l'eau distillée.

TECHNIQUE

Extraction

Introduisez successivement, dans une ampoule à décantation :

50 ml de vin ou de jus de raisin.

10 g environ de sulfate de sodium cristallisé.

50 ml d'éther de pétrole.

Agitez pendant cinq à dix minutes. Après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, vidangez la phase inférieure dans une deuxième ampoule à décantation.

Lavez l'éther de pétrole par agitation légère avec 20 ml d'eau distillée.

Ajoutez 50 ml d'éther de pétrole dans la deuxième ampoule, agitez modérément et laissez reposer.

Rejetez la phase inférieure de la deuxième ampoule, vidangez dans cette ampoule l'eau de lavage de la première ampoule, agitez et rejetez cette eau. Lavez une deuxième fois l'éther de la première ampoule avec 10 ml environ d'eau distillée qui est encore utilisée pour laver l'éther de la deuxième ampoule.

Réunissez les deux phases éthérées dans une éprouvette. Divisez l'extrait en deux parties égales dans deux béchers secs et après avoir ajouté 0,5 ml de solution k pou réduire les pertes de HCH et de gamma HCH, évaporez presque à sec au bain-marie, en projetant un jet d'air froid sur la surface du liquide. Cette évaporation pourra être réalisée dans un appareil rotatif à vide ; en ce cas, une attention particulière sera apportée à la récupération de la totalité de l'extrait réparti sur les parois du ballon.

Chromatographie

La chromatographie sera exécutée sur deux plaques distinctes pour utiliser les deux modes d'élution.

Dépôt des spots :

Par des lavages répétés à l'éther de pétrole, transférez, au moyen d'une seringue, le résidu d'évaporation, correspondant ici à 25 ml d'échantillon, sur la position de départ de la chromatographie.

Si l'évaporation a été faite dans un ballon (évaporateur rotatif) de capacité importante, rincez en un premier temps le ballon avec quelques ml d'acétone redistillée, à plusieurs reprises, en collectant les liqueurs de lavage dans un petit bécher de 50 ml ; évaporez juste à sec l'acétone, lavez les parois du bécher avec un minimum d'éther de pétrole et déposez cette dernière solution sur la plaque.

Les positions de départ sont disposées de 2 en 2 cm sur une ligne distante de 5 cm du bord de la plaque (côté opposé à celui qui a trempé dans l'eau). Les deux spots extrêmes étant à 3 cm des bords, huit positions sont disponibles.

Des solutions titrées de références seront toujours disposées sur chaque plaque pour contrôler la sensibilité et identifier éventuellement les produits décelés.

5 microlitres de solution de références contenant respectivement 1 g par litre de chacun des insecticides à rechercher, pourront être déposés soit séparément, soit simultanément si leurs Rf le permettent.

La dernière position sera occupée par quatre microlitres du mélange de colorants ; ces derniers ne sont pas séparés par le mélange à 1 p. 100 de méthanol mais ils migrent avec des Rf voisins de 0,53 - 0,56 et 0,88 avec le mélange à 7 p. 100.

Elution

La (ou les) plaques sont introduites dans la petite cuve pour chromatographie en couche mince, dont l'atmosphère est saturée par l'introduction préalable du mélange éluant à 1 p. 100 de méthanol dans l'éther de pétrole redistillé ou du mélange à 7 p. 100 de méthanol.

La hauteur de solvant dans lequel trempe la plaque ne doit pas dépasser 0,5 cm. La chromatographie dure ainsi 45 minutes environ pour un déplacement du front au-dessus de la ligne zéro des spots de 10 cm environ.

Notez la position du front dès la sortie des plaques de la cuve.

Révélation des insecticides organochlorés :

Après évaporation du solvant, pulvérisez sur toute la plaque le réactif révélateur de Mitchell.

Irradiez la plaque sous un flux de lumière ultraviolette (254 microgrammes) pendant vingt minutes.

Les taches des insecticides organochlorés sont visibles sur le fond fluorescent pendant l'irradiation et laissent des taches brunes sur fond blanc perceptibles pour des doses inférieures au microgramme, mais vraiment incontestables seulement au-dessus de 2 microgrammes.

Les plaques ont tendance à brunir par la suite, mais la lecture est encore très nette vingt-quatre heures après la révélation.

Les vins et les jus de raisin exempts d'insecticides organochlorés ne donnent aucune tache, à l'exception de la tache foncée du point de départ.

L'identité des insecticides organochlorés éventuellement observés sera déduite par comparaison de leur Rf par rapport à ceux des témoins obtenus dans le même essai.

Le dosage approximatif pourra être obtenu après un premier essai indicatif de la dose probable, par un deuxième essai encadré de doses croissantes entre 1 et 10 microgrammes de l'insecticide présumé.

A titre indicatif, les Rf suivants ont été observés :

Tableau 1 - Rf des insecticides organochlorés sur silicagel G. MERCK (élution avec de l'éther de pétrole à 1 p. 100 de méthanol) :

HEOD ... 0,05

Endrine ... 0,07

HCH technique ... 0,1 - 0,2 - 0,3 - 0,4 - 0,5

Gamma HCH ... 0,3

DDE technique ... 0,63 - 0,67

Zeidane ... 0,59 - 0,62

Heptachlore et heptachlore ep ... 0,65 - 0,68

Chlordane ... 0,6 - 0,65 - 0,7

Toxaphène ... Bande continue à 0,4 à 0,65

HHDN ... 0,75 - 0,95

Le mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol sépare les insecticides organochlorés les plus polaires comme l'endrine, l'HEOD, le chlorobenzilate, le méthoxychlore et le phaltane ainsi que quelques composés simultanément organophosphorés et organohalogénés tels que le naled et le bromophos.

Tableau 2 - Rf des insecticides organohalogénés sur Silicagel G. MERCK (élution avec l'éther de pétrole à 7 p. 100 de méthanol) :

Naled ... 0,15

Dicofol ... 0,3 - 0,9

Phaltane ... 0,34

Chlorobenzilate... 0,38

Méthoxychlore ... 0,73

Bromophos ... 0,75

HEOD ... 0,76

Endrine ... 0,80

L'utilisation séparée des deux mélanges éluants donne plus de valeur au résultat qualitatif.

Les pesticides correctement élués avec le mélange à 1 p. 100 de méthanol migrent avec le front du mélange à 7 p. 100, inversement les pesticides correctement élués avec le mélange à 7 p. 100 ne migrent pratiquement pas avec le mélange à 1 p. 100.

Lorsque l'analyse par chromatographie en couche mince sera appliquée à l'étude des éluats E1 - E2 - E3 donnés par le fractionnement sur florisil, le mélange éluant à 1 p. 100 de méthanol sera utilisé dans le cas de l'éluat E13, tandis que le mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol sera réservé à la chromatographie des éluats E2 et E9.