L'extraction des pesticides est réalisée par l'éther de pétrole. Après purification par chromatographie sur colonne de florisil, la chromatographie gazeuse avec détecteur à capture d'électrons permet de certifier l'absence d'un certain nombre d'insecticides au-dessus d'une concentration déterminée et très faible.

La présomption de l'identité des produits éventuellement détectés avec celle d'un insecticide déterminé sera établie par la concordance de diverses informations données par l'analyse complète.

MATERIEL

Ampoules à décantation de 125 ml et 500 ml, à robinets téflon et bouchons de verre rodé, non graissés, équipés de manchon téflon.

Evaporateur rotatif sous vide.

Bain-marie.

Colonne à chromatographie 20 X 600 mm à robinet téflon.

Chromatographie à détecteur à capture d'électrons.

Colonnes par chromatographie gazeuse : toute colonne généralement utilisée pour l'analyse des résidus de pesticides peut être prise, en particulier les colonnes en verre résistant à la chaleur 5° 1/8" garnies des phases DC 200 à 10 p. 100 ou QF 1 à 6 p. 100 sur un rapport habituel de 80/100 mesh, tel que le chromosorb G, etc..

Chromatographe à détecteur thermoionique et microcoulométrique.

REACTIFS

a) Ether de pétrole purifié :

L'éther de pétrole brut 40-65° ordinaire est agité mécaniquement trente minutes environ avec 5 p. 100 de son volume d'acide sulfurique concentré. Après repos, séparation de l'acide et lavage à l'eau distillée, l'éther est agité mécaniquement dans la même ampoule avec 5 p. 100 de son volume de lessive de soude 36° dilué au demi.

Après repos et séparation de la phase alcaline, lavage à l'eau distillée, le milieu est à nouveau agité trente minutes avec environ 5 p. 100 de son volume d'acide sulfurique au cinquième en volume et 3 p. 100 de son volume de solution aqueuse de permanganate de potassium à 1 p. 100.

L'éther purifié est ensuite rectifié dans une colonne rectificatrice sous un taux de reflux très faible qui permet une distillation rapide.

L'appareil à distiller entièrement en verre ne sera muni que d'un seul robinet en téflon pour le réglage du taux de reflux.

Essai de l'éther de pétrole purifié :

Concentrez à 0,5 ml dans les conditions utilisées pour les recherches de résidus (évaporateur sous vide, ou bien jet d'air froid et filtré), 50 ml d'éther de pétrole préalablement desséché par 1 g de sulfate de sodium anhydre, en présence de 0,5 ml de solution d'huile de paraffine à 1 p. 100 dans l'éther de pétrole anhydre.

Au moyen d'une seringue propre de 10 microlitres, injectez 5 microlitres de cet extrait dans les conditions de la recherche de résidus.

Il ne doit pas être observé de pic (en dehors du solvant), ou tout au moins il ne devra pas être observé de pic dépassant 10 p. 100 de l'échelle de l'enregistreur dans les conditions habituelles de sensibilité.

Un pic de cet ordre pouvant être donné par environ 0,05 ng d'insecticide organochloré, la pureté de l'éther de pétrole utilisé équivaut alors à une teneur apparente en insecticide de l'ordre de 0,0001 mg/l, soit 0,1 microgramme.

b) Eau distillée lavée :

Lavez l'eau distillée obtenue dans un appareil entièrement en verre par deux fois le quart environ de son volume d'éther de pétrole purifié.

NOTA - L'eau minérale Charrier peut être utilisée au lieu et place d'eau distillée lavée.

c) Acétonitrile fraîchement distillé sur quelques gouttes d'acide phosphorique.

d) Sulfate de sodium cristallisé R.P..

e) Sulfate de sodium anhydre pur et florisil :

Ces réactifs sont maintenus avant l'emploi quarante-huit heures au moins dans un four à 180° C.

f) Florisil :

Le florisil est ensuite conservé dans une étuve à 130° C. Prélevez, douze à vingt-quatre heures avant l'emploi, 100 g de florisil dans un petit flacon poudrier et après refroidissement, ajoutez 5 ml d'eau distillée lavée. Bouchez et agitez pour homogénéiser. Chaque lot ainsi préparé sera utilisé dans les trois jours suivants, période pendant laquelle il sera conservé à la température ordinaire.

g) Solutions de références :

A partir de produits étalons, préparez par dilutions successives des solutions de référence des insecticides à rechercher.

La première solution relativement concentrée pourra être dans l'acétone, les dilutions suivantes dans l'éther de pétrole.

Pour la recherche avec un détecteur à capture d'électrons de sensibilité moyenne, les dilutions finales seront préparées en fonction des réponses particulières de chaque insecticide, soit par exemple :

0,1 mg/l pour : gamma HCH, HCH, HHDN, HCB.

0,5 mg/l pour : HEOD, endrine.

1,0 mg/l pour zeidane, DDE, heptachlore, heptachlore-époxyde, dicofol, DDD, soufre, dichlofluanide, bromophos, phenthoate.

2,0 mg/l pour : chlordane, toxaphène.

5,0 mg/l pour : méthoxychlore, tétradifon, parathion, carbophénothion, diazinon.

20 mg/l pour : chlorobenzilate, dinocap.

h) Ether sulfurique : fraîchement redistillé, anhydre.

i) Mélange éluant :

Ether sulfurique anhydre ... 20 volumes.

Ether de pétrole purifié ... 80 volumes.

k) Solution à 1 p. 100 d'huile de paraffine dans l'éther de pétrole.

TECHNIQUE

Extraction du vin ou du jus de raisin

Introduisez dans une ampoule à décantation :

100 ml de jus de raisin ou de vin.

10 g de sulfate de sodium cristallisé R.P. (à dissoudre progressivement).

75 ml d'éther de pétrole.

Agitez modérément pendant cinq minutes et laissez reposer jusqu'à séparation des deux phases. Soutirez la phase aqueuse dans un bécher et décantez la phase éthérée dans un bécher renfermant 1 à 2 g de sulfate de sodium anhydre et de celui-ci dans un deuxième bécher sec avant transvasement dans le ballon de l'évaporateur rotatif. Epuisez à nouveau la phase aqueuse dans l'ampoule de 75 ml d'éther de pétrole. Après repos et séparation, transvasez la phase éthérée dans le ballon de l'évaporateur après décantations successives dans les deux béchers précédents. Ajoutez 1 ml de solution k et concentrez sous vide à basse température jusqu'à 10-15 ml environ.

Extraction des raisins

A partir de 2 kg de raisins, préparez un échantillon moyen de 600 g environ.

Séparez les grains. Réduisez-les en bouillie au mixeur. Pesez 100 g de bouillie fluide et introduisez-les dans un flacon de 1 litre à large col.

Ajoutez 100 ml d'éther de pétrole, traitez quelques secondes au mixeur, agitez mécaniquement 20 minutes.

Versez le mélange hétérogène sur un filtre aluminium. Filtrez le liquide ainsi séparé sur un tampon de laine de verre en recevant les liqueurs dans une ampoule à décantation.

Reversez la phase aqueuse et la pulpe retenue sur le filtre dans le flacon ; ajoutez 75 ml d'éther de pétrole, traitez quelques secondes au mixeur et agitez mécaniquement pendant 10 minutes.

Filtrez la phase éthérée dans l'ampoule à décantation après en avoir retiré le premier extrait éthéré.

Séparez la couche aqueuse.

Lavez les phases éthérées rassemblées deux fois avec 10 ml d'eau distillée lavée. Séchez l'éther sur sulfate de sodium anhydre.

Concentrez sous vide à basse température jusqu'à 10-15 ml environ.

Purification de l'extrait

a) Préparation de la colonne :

Tassez dans la colonne :

2,5 cm de sulfate de sodium anhydre.

5 cm environ de florisil (10 g).

2,5 cm de sulfate de sodium anhydre.

Lavez le contenu de la colonne par 50 ml de mélange éluant suivi de 50 ml d'éther de pétrole purifié.

b) Opération :

Après ce lavage, introduisez l'extrait éthéré concentré dans la colonne : rincez le ballon de l'évaporateur rotatif et les parois de la colonne avec de petites fractions d'éther de pétrole purifié prélevé sur une réserve de 100 ml.

Recueillez l'éluat obtenu E1 dans un bécher de 150 ml.

Introduisez ensuite successivement dans la colonne :

50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E2 ET 50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E3.

Une liste (non limitative) des pesticides qui peuvent être séparés dans les différents éluats est donnée au tableau 1.

TABLEAU N° 1

Séparation des pesticides donnée par la chromatographie

sur la colonne de florisil indiquée.

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Analyse par chromatographie gazeuse

L'éluat E12 après addition de 0,5 ml de solution k est préalablement concentré à 50 ml par évaporation au bain-marie et sous jet d'air froid.

Les éluats E2 et E3 seront de même concentrés à 10 ml.

Les conditions habituelles de l'analyse chromatographique ayant été préalablement mises au point avec l'appareil disponible, injectez 4 microlitres de chacun des éluats concentrés, sur colonne garnie de silicone DC 200 ou QF 1.

En négligeant les pics donnés dans les conditions de travail favorables et par un détecteur de sensibilité moyenne par les quantités de pesticides indiquées dans la deuxième colonne du tableau suivant, l'injection effectuée permet d'assurer l'absence de teneurs supérieures à celles indiquées dans la troisième colonne du même tableau.

Si jugé utile, la limite de sensibilité pourra être abaissée en concentrant à 10 ou 5 ml les éluats (4e colonne du tableau n° 2).

TABLEAU N° 2

Limites de sensibilité de la méthode

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NOTA :

A - QUANTITE MINIMALE considérée comme valable pour l'analyse.

B - LIMITE THEORIQUE (en mg/l) qui en résulte après injection de 4 microlitres d'éluat provenant de 100 ml de vin concentré.

CALCUL

Lorsqu'une réponse positive est enregistrée après chromatographie sur l'une des deux colonnes DC 200 ou QF 1, l'analyse sera répétée avec le même extrait sur la deuxième colonne.

La présomption de la présence d'un insecticide déterminé sera donnée en première analyse par les critères suivants :

Possibilité de la présence de ce produit dans l'éluat E1, E2, ou E3 ;

Conformité des temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN dans les deux conditions opératoires différentes ;

Conformité des résultats quantitatifs donnés par les deux chromatographies effectuées.

Les teneurs apparentes seront calculées par comparaison entre les surfaces des pics observés et celles voisines des pics donnés par les solutions étalons dans les mêmes conditions opératoires, immédiatement avant ou après l'analyse de l'inconnu.

La surface d'un pic sera déterminée soit en utilisant les données de l'intégrateur disponible, soit par le produit de la hauteur réelle du pic par sa largeur mesurée à 54,6 p. 100 de la hauteur totale comptée à partir du sommet.

Après avoir assuré par l'une au moins des techniques indiquées plus loin (a - b - c - d) ou par l'une des méthodes précédemment exposées (méthodes 1 à 5) l'identification définitive du résidu, la teneur trouvée sera corrigée après détermination du rendement de la technique par une analyse de l'échantillon additionné avant l'extraction d'une dose connue - égale ou voisine de celle trouvée - du pesticide incriminé.

Cette détermination ne sera utile que si la teneur trouvée initialement est à la fois inférieure et du même ordre de grandeur qu'une tolérance en vigueur puisque le rendement est normalement supérieur à 80 p. 100 pour les produits stables (organo-halogénés en général) et supérieur à 60 p. 100 pour les substances à dégradation plus rapide (organo-phosphorés en particulier).

Elle ne sera pas indispensable lorsque la teneur trouvée sera supérieure à une tolérance en vigueur, notamment pour les tolérances nulles.

Identification par chromatographie gazeuse

a) Temps de rétention relatifs.

Le temps de rétention relatif trr du composé à identifier sera déterminé par chromatographie sur colonnes DC 200 et QF 1 en présence d'HHDN, élément de référence.

Les valeurs de trr seront précisées au moment de l'analyse ; les trr donnés dans le tableau 2 peuvent être consultés à titre indicatif.

TABLEAU N° 3

Temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN

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b) Coefficient d'extraction (éther de pétrole, acétonitrile).

La détermination d'un coefficient d'extraction : fraction d'insecticide subsistant dans l'éther de pétrole après agitation avec un volume d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole, pourra contribuer à l'identification d'un produit inconnu.

Ce coefficient sera déterminé comme suit :

Dans une ampoule à robinet téflon de 125 ml, introduisez :

5 ml d'éluat E1 ou E2 concentré à 10 ml, par exemple, soit E cette solution.

5 ml d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole.

Agitez. Après repos et complète séparation des phases, évacuez la phase acétonitrile.

Lavez la phase éthérée avec 5 ml d'eau distillée. Filtrez la phase éthérée sur sulfate de sodium : soit E' la solution obtenue. Injectez 2 nl de cette solution dans le chromatographe.

Comparez les diagrammes correspondants aux injections de 2 microlitres de solution E et de 2 microlitres de solution E'.

Le rapport des surfaces des pics SE et SE' ayant le même temps de rétention dans les deux cas, donne la valeur p du coefficient de partage recherché.

S Quantité d'insecticide restant dans l'éther

E' de pétrole après partage

--- = ------------------------------------------- = p.

S quantité d'insecticide totale

E Les valeurs de p obtenues dans les conditions opératoires indiquées sont les suivantes :

Gamma HCH ... p = 0,24 plus ou moins 0,02

HHDN ... p = 0,92 plus ou moins 0,02

HEOD ... p = 0,46 plus ou moins 0,02

endrine ... p = 0,47 plus ou moins 0,03

pp' DDE ... p = 0,58 plus ou moins 0,02

op' DDT ... p = 0,53 plus ou moins 0,03

pp' DDT ... p = 0,37 plus ou moins 0,02

c) Analyse par microcoulométrie

Les éluats E1 et E2 dans lesquels auront été décelés des résidus d'insecticides organochlorés pourront être analysés par chromatographie gazeuse avec détecteur microcoulométrique après concentration suffisante, de manière à injecter 20 à 50 microlitres d'une solution titrant au moins 1 mg/kg de l'insecticide présumé.

d) Analyse par le détecteur thermo-ionique

Les éluats E2 et E3 dans lesquels auront été mis en évidence, au moyen du détecteur à capture d'électron, des résidus apparents d'insecticides organophosphorés pourront être soumis à l'analyse chromatographique avec détecteur thermo-ionique pour confirmer l'identité de ces composés.

Les éluats E2 et E3 seront analysés directement ou après concentration, de manière à soumettre à la chromatographie une solution titrant environ 5 mg/kg en insecticide présumé. Injectez 2 à 4 microlitres.

RECHERCHE DES INSECTICIDES PAR CHROMATOGRAPHIE EN

COUCHE MINCE

Les techniques décrites pour la recherche directe par chromatographie en couche mince des insecticides organochlorés et organothiophosphorés dans le vin peuvent être suivies sans modification (en ce qui concerne la préparation des plaques et la chromatographie) pour confirmer la présence d'éventuels insecticides dans les éluats E1, E2 et E3. Se reporter aux textes des méthodes I - 4 et I - 5.