1. - Objet.

La préparation de l'échantillon pour essai a pour objet l'obtention d'un produit suffisamment homogène pour permettre des prises d'essai représentatives de la confiture en vue de la mise en oeuvre des méthodes d'analyse décrites ci-après. Les gelées, crèmes de marron, crèmes de pruneaux ou préparations similaires, suffisamment homogènes pour les besoins de l'analyse, ne nécessitent pas le traitement ci-après.

2. - Mode opératoire.

L'échantillon contenu dans le conditionnement de commercialisation ou le récipient de prélèvement sera en totalité broyé et homogénéisé dans un appareil approprié.

Note. - La prise d'essai pour la détermination de la teneur en dioxyde de soufre devra être faite en priorité à l'issue de cette préparation.

1. - Définition.

L'indice de réfraction est le rapport des vitesses de la lumière dans l'air et dans le produit.

2. - Principe.

Mise en évidence de l'angle limite de réflexion de la lumière sur la surface de séparation entre le produit et un milieu solide homogène transparent.

3. - Appareillage.

Réfractomètre de type ABBE, gradué en millième d'unité et permettant d'apprécier le dix-millième, muni d'un thermomètre et d'un dispositif de circulation d'eau ; l'échelle de graduation doit s'étendre au moins entre 1,418 et 1,478.

4. - Mode opératoire.

4.1. Amener la température de mesure à une valeur voisine de 20 °C.

4.2. Placer une petite quantité de l'échantillon pour essai sur le prisme et refermer immédiatement (si nécessaire, exprimer préalablement l'échantillon pour essai à travers un morceau de tissu de texture appropriée).

4.3. Procéder à trois lectures successives à 0,0001 près.

5. - Expression des résultats.

5.1. Mode de calcul.

Prendre comme résultat exprimé avec quatre décimales la moyenne des trois lectures effectuées en 4.3.

5.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 0,0002.

5.3 Correction à apporter à l'indice de réfraction lu à une température différente de 20 °C.

Température et correction : (Tableau non reproduit)

5.4 La table de correspondance n° 1 donne les valeurs de l'extrait réfractométrique en % m/m exprimé en saccharose.

Table de correspondance n° 1 : (Tableau non reproduit)

1. Définition.

La matière sèche totale est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en pourcentage en masse.

2. Principe.

Dessiccation à l'étuve à 70 °C sous pression réduite et pesée du résidu.

3. Réactif.

3.1. Sable dit "de Fontainebleau" ou de qualité équivalente.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Etuve à vide réglée à 70 °C 7 1 °C sous une pression de 3.103 pascal (3.10-2 bar), par circulation d'air sec. Des dispositifs de dessiccation de l'air et de réglage du débit doivent être prévus en amont.

4.2. Capsule cylindrique en acier inoxydable de 60 mm de diamètre et de 25 mm de hauteur, munie de son couvercle.

4.3. Dessiccateur.

5. Mode opératoire.

5.1. Tarer à 1 milligramme près la capsule (4.2) contenant environ 10 grammes de sable (3.1) et un petit agitateur en verre à extrémité aplatie.

5.2. Introduire dans la capsule environ 2 à 5 grammes d'échantillon pour essai pesés au milligramme près. Triturer soigneusement le contenu de la capsule à l'aide de l'agitateur.

5.3. Placer la capsule ouverte et son couvercle dans l'étuve (4.1) pendant six heures.

5.4. Dès l'ouverture de l'étuve, obturer la capsule avec son couvercle et la placer dans le dessiccateur (4.3) jusqu'à complet refroidissement. Peser à 1 milligramme près.

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule.

La teneur en matière sèche totale est donnée par la relation suivante : matière sèche % m/m = m2 - m0m1 - m0 H 100,

où :

m0 est la masse, en gramme, de la capsule préparée en 5.1 ;

m1 est la masse, en gramme, de la capsule préparée en 5.2 ;

m2 est la masse, en gramme, de la capsule après dessiccation (5.4).

6.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 0,05.

1. Définition.

La teneur en matières insolubles est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en pourcentage en masse.

2. Principe.

Pesée du résidu insoluble dans l'eau chaude, après filtration et dessiccation à l'étuve à 100 °C.

3. Réactifs.

L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

3.1. Acétone de qualité analytique.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Etuve réglée à 100 °C 7 1 °C.

4.2. Capsule cylindrique en acier inoxydable de 60 mm de diamètre et de 25 mm de hauteur, munie de son couvercle.

4.3. Papier filtre, qualité sans cendres, à filtration rapide ou toute autre matière filtrante équivalente.

4.4. Dessiccateur.

4.5. Centrifugeuse équipée de pots de 100 ml.

5. Mode opératoire.

5.1. Placer le filtre (4.3) sur un entonnoir au-dessus d'une fiole conique de 500 ml ; le laver à l'eau chaude, le rincer à l'acétone (3.1) et le placer dans la capsule (4.2). Après quelques minutes, introduire cette dernière dans l'étuve (4.1) et l'y laisser une demi-heure. Obturer la capsule avec son couvercle et la placer dans le dessiccateur (4.4) jusqu'à complet refroidissement. Peser à 1 mg près.

5.2. Peser à 0,1 g près environ 10 grammes d'échantillon pour essai dans un pot de centrifugeuse (4.5). Laver à plusieurs reprises (en général 4 à 5 fois) avec environ 50 ml d'eau chaude (70 à 80 °C). Centrifuger après chaque lavage pendant 5 minutes, verser le surnageant sur le filtre préparé en 5.1 et placé dans un entonnoir sur une fiole conique de 500 ml. Transférer le culot de centrifugation sur le filtre, rincer et placer le filtre dans la capsule (4.2). Porter l'ensemble dans l'étuve (4.1) et l'y laisser pendant deux heures.

5.3. Dès l'ouverture de l'étuve, obturer la capsule avec son couvercle et la placer dans le dessiccateur (4.4) jusqu'à complet refroidissement. Peser à 1 mg près.

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule.

La teneur en matières insolubles est donnée par la relation suivante : matières insolubles % m/m = m2 - m0m1H 100,

où :

m0 est la masse, en gramme, de la capsule préparée en 5.1 ;

m1 est la masse, en gramme, de la prise d'essai 5.2 ;

m2 est la masse, en gramme, de la capsule après dessiccation 5.3. 6.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 0,1.

1. Définition.

Les cendres sont le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elles sont exprimées en pourcentage en masse.

2. Principe.

Incinération à 525 7 25 °C de l'échantillon pour essai préalablement desséché.

3. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

3.1. Capsule en platine ou en tout autre matériau équivalent de 120 mm de diamètre et 40 à 45 mm de hauteur.

3.2. Dispositif de chauffage réglable permettant la préincinération du produit.

3.3. Four électrique à moufle, réglé à 525 7 25 °C.

3.4. Dessiccateur.

4. Mode opératoire.

4.1. Placer dans la capsule (3.1), tarée préalablement à 0,2 mg près, environ 20 grammes de l'échantillon pour essai, pesés à 10 mg près.

4.2. Procéder à la préincinération du contenu de la capsule en chauffant progressivement à l'aide du dispositif (3.2).

4.3. Placer la capsule dans le four (3.3). Incinérer jusqu'à l'obtention d'un résidu exempt de particules charbonneuses.

4.4. Placer la capsule dans le dessiccateur (3.4). Après refroidissement, peser la capsule à 0,2 mg près.

5. Expression des résultats.

5.1. Mode de calcul et formule.

La teneur en cendres est donnée par la relation suivante : Cendres % m/m = m2 - m0m1 - m0 H 100,

où :

m0 est la masse, en gramme, de la capsule vide (3.1) ;

m1 est la masse, en gramme, de la capsule contenant la prise d'essai (4.1) ;

m2 est la masse, en gramme, de la capsule après incinération (4.4).

5.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre, par le même analyste, ne doit pas excéder 0,05.

1. Définition.

La teneur en sodium est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en milligramme pour 100 grammes.

2. Principe.

Détermination par photométrie d'émission de flamme sur une solution obtenue à partir des cendres du produit.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

3.1. Solution étalon de sodium à 1 gramme par litre : peser 2,542 grammes de NaCl (préalablement séché à 100/110 °C), dissoudre dans un peu d'eau et compléter à 1 000 millilitres.

3.2. Solution d'acide chlorhydrique environ M.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

Photomètre de flamme utilisant un mélange de gaz permettant d'obtenir une température de flamme peu élevée (par exemple, butane-air) afin d'éviter l'interférence éventuelle d'autres cations et réglé pour effectuer des mesures à la longueur d'onde correspondant au maximum d'émission du sodium (589 nm).

5. Mode opératoire.

5.1. Préparer les cendres du produit selon le document "Détermination des cendres".

5.2. Reprendre les cendres par quelques millilitres d'eau, les dissoudre avec un minimum de solution (3.2) en chauffant légèrement. Après refroidissement, transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 50 millilitres et compléter le volume avec de l'eau.

5.3. Etalonnage.

5.3.1. Préparer à partir de la solution (3.1) une série de solutions diluées correspondant au domaine d'utilisation optimal du photomètre.

5.3.2. Etalonner le photomètre.

5.3.3. Tracer la courbe d'étalonnage en portant en abscisse les teneurs en sodium exprimées en milligramme par litre et en ordonnée les émissions correspondantes.

5.4. Lire la valeur relevée pour la solution préparée en 5.2.. Diluer éventuellement cette solution pour que la réponse du photomètre se situe dans la zone moyenne de la courbe (5.3.3).

5.5. Calculer la concentration C en milligrammes de sodium par litre de la solution obtenue en 5.2 ou de sa dilution obtenue en 5.4 au moyen de la courbe d'étalonnage (5.3.3).

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule :

La teneur en sodium est donnée par la relation suivante : Sodium mg/100 grammes = C . 5 dm

où :

d est le facteur de dilution utilisé éventuellement en 5.4 ;

m est la masse, exprimée en grammes, de l'échantillon utilisé en 5.1.

6.2 Répétabilité :

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 5 p. 100 en valeur relative.

1. Définition.

La teneur en potassium est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en milligramme pour 100 grammes.

2. Principe.

Détermination par photomètrie d'émission de flamme sur une solution obtenue à partir des cendres du produit.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

3.1. Solution étalon de potassium à 1 gramme par litre : peser 1,907 g de KC1 (préalablement séché à 100/110 °C), dissoudre dans un peu d'eau et compléter à 1 000 ml.

3.2. Solution d'acide chlorhydrique environ M.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

Photomètre de flamme utilisant un mélange de gaz permettant d'obtenir une température de flamme peu élevée (par exemple butane/air) afin d'éviter l'interférence éventuelle d'autres cations et réglé pour effectuer des mesures à la longueur d'onde correspondant au maximum d'émission du potassium (766,5 nm).

5. Mode opératoire.

5.1. Préparer les cendres du produit selon le document "Détermination des cendres".

5.2. Reprendre les cendres par quelques millilitres d'eau, les dissoudre avec un minimum de solution (3.2) en chauffant légèrement. Après refroidissement, transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 50 ml et compléter le volume avec de l'eau.

5.3. Etalonnage.

5.3.1. Préparer à partir de la solution (3.1) une série de solutions diluées correspondant au domaine d'utilisation optimal du photomètre.

5.3.2. Etalonner le photomètre.

5.3.3. Tracer la courbe d'étalonnage en portant en abscisse les teneurs en potassium exprimées en milligramme par litre et en ordonnée les émissions correspondantes.

5.4. Lire la valeur relevée pour la solution préparée en 5.2.. Diluer éventuellement cette solution pour que la réponse du photomètre se situe dans la zone moyenne de la courbe (5.3.3).

5.5. Calculer la concentration C en milligramme de potassium par litre de la solution obtenue en 5.2 ou de sa dilution obtenue en 5.4, au moyen de la courbe d'étalonnage (5.3.3).

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule :

La teneur en potassium est donnée par la relation suivante :

Potassium mg/100 g = C . 5 dm,

où :

d est le facteur de dilution utilisé éventuellement en 5.4 ;

m est la masse, exprimée en gramme, de l'échantillon utilisé en 5.1.

6.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 5 p. 100 en valeur relative.

1. Définition.

La teneur en dioxyde de soufre est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en milligramme par kilogramme.

2. Principe.

Entraînement par un courant d'azote du dioxyde de soufre extrait du produit acidifié et chauffé.

Fixation et oxydation du dioxyde de soufre par barbotage dans une solution neutre de peroxyde d'hydrogène.

Dosage par une solution d'hydroxyde de sodium de l'acide sulfurique formé.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée récemment bouillie.

3.1. Azote pur.

3.2. Solution de peroxyde d'hydrogène à 9,1 grammes H2O2 par litre.

3.3. Solution d'acide chlorhydrique à environ 100 g d'HC1 par litre obtenue par dilution à 25 p. 100 (v/v) de l'acide concentré (r 20 = 1,19 g/ml).

3.4. Indicateur coloré - colorant RB.

Dans une fiole de 100 ml, introduire 0,2 gramme de rouge de méthyle et 0,1 gramme de bleu de méthylène, ajouter de l'éthanol à 95 p. 100 par volume. Agiter pour dissoudre et compléter au trait de jauge avec l'éthanol.

3.5. Solution d'hydroxyde de sodium 0,01 N.

3.6. Solution de disulfite de potassium : dans une fiole de 1 000 ml contenant environ 200 ml d'eau, dissoudre 1,20 gramme de disulfite de potassium et 0,20 gramme de sel disodique de l'acide éthylènediamine tétraacétique (E.D.T.A.) ; compléter au trait de jauge avec de l'eau.

La teneur en dioxyde de soufre de cette solution sera déterminée avant emploi.

3.7. Solution de saccharose à 100 grammes par litre.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Appareil d'entraînement selon schéma, ou équivalent, comprenant :

- un ballon à fond rond (A), de 500 ml de capacité, muni de deux tubulures latérales, l'une pour l'arrivée d'azote, l'autre surmontée d'un réservoir (C).

- un réfrigérant (R) à reflux ;

- un barboteur (B), forme coeur, de 200 ml de capacité ;

- un tube d'amenée dans le barboteur, terminé par un verre fritté permettant d'obtenir un bullage adéquat, et raccordé au réfrigérant par un rodage sphérique.

4.2. Cet appareil doit satisfaire aux trois essais de contrôle suivants :

4.2.1. Pas d'entraînement de l'acidité.

Introduire dans le ballon (A), 150 ml d'eau et 5 ml de solution acide (3.3), chauffer à reflux pendant une heure en faisant passer un courant d'azote. Le barboteur (B) contient 5 ml d'eau et 0,1 ml d'indicateur (3.4).

Le contenu du barboteur doit rester neutre.

4.2.2. Pas de surchauffe dans le ballon.

Introduire dans le ballon (A), 20 ml de solution de saccharose (3.7) et 130 ml d'eau. Chauffer à reflux pendant une heure en faisant passer un courant d'azote.

La solution de saccharose doit rester incolore ; il ne doit pas y avoir de caramélisation sur les parois du ballon.

4.2.3. Entraînement quantitatif du dioxyde de soufre.

Introduire dans le ballon (A), 20 ml de solution de disulfite de potassium (3.6) et 80 ml d'eau.

Effectuer l'entraînement et le dosage dans les mêmes conditions que pour l'essai proprement dit.

5. Mode opératoire.

5.1. Introduire dans le réservoir (C) environ 50 grammes, exactement pesés (soit m), de l'échantillon pour essai, ajouter 100 ml d'eau.

5.2. Mettre dans le barboteur (B), 5 ml de solution de peroxyde d'hydrogène (3.2), 0,1 ml d'indicateur coloré (3.4) et neutraliser à l'aide de la solution d'hydroxyde de sodium (3.5). La teinte du virage sera retenue comme coloration témoin.

5.3. Adapter le réfrigérant ascendant et le barboteur, faire circuler un courant d'azote pour chasser l'air contenu dans l'appareil.

5.4. Faire couler dans le ballon (A) la solution contenue dans le réservoir (C), ajouter 5 ml d'acide chlorhydrique (3.3) par le réservoir (C).

5.5. Porter lentement le contenu du ballon à ébullition et maintenir celle-ci en faisant circuler un courant régulier d'azote. Continuer l'entraînement pendant une heure et remplacer le premier barboteur par un deuxième contenant une solution de peroxyde d'hydrogène préparée dans les mêmes conditions qu'en 5.2 ; maintenir l'entraînement pendant 30 minutes.

5.6. Titrer l'acide sulfurique formé dans le premier barboteur par une solution d'hydroxyde de sodium (3.5) (soit v ml). Procéder éventuellement de la même façon pour le deuxième barboteur (soit v'ml).

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule :

La teneur en dioxyde de soufre est donnée par la relation suivante : Dioxyde de soufre mg/kg = 0,32. (v + v')m . 103,

où :

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai.

v et v' sont les volumes d'hydroxyde de sodium utilisés en 5.6. 6.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 10 p. 100 en valeur relative.

1. Définition.

Les anthocyanes et le rouge de betterave sont les pigments naturels isolés et identifiés par l'application de la méthode décrite ci-après.

2. Principe.

Isolement des anthocyanes et du rouge de betterave à l'état de complexes avec le plomb, suivi d'extraction par le butanol - 1 et identification par chromatographie sur couche mince de cellulose.

Après hydrolyse des anthocyanes et extraction par le méthyl - 3 butanol - 1 des anthocyanidols libérés, identification de ceux-ci par chromatographie sur couche mince de cellulose.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

3.1. Acide acétique r20 = 1,05 g/ml.

3.2. Acide chlorhydrique r20 = 1,19 g/ml.

3.3. Solution d'acide chlorhydrique 2 M.

3.4. Acide formique r20 = 1,22 g/ml.

3.5. Ethanol à 80 p. 100 en volume.

3.6. Butanol - 1.

3.7. Méthyl - 3 butanol - 1.

3.8. Solution d'acétate de plomb Pb (CH3 COO)2, 3H2O à 80 grammes par litre.

3.9. Hydroxyde d'ammonium r20 = 0,90 g/ml.

3.10. Hexane.

3.11. Eluants des anthocyanes.

3.11.1. Acide formique - acide chlorhydrique - eau (1.4.8) v/v/v. 3.11.2. Butanol - 1 - acide chlorhydrique - eau (5.2.1) v/v/v.

3.12. Eluants des anthocyanidols.

Acide acétique - acide chlorhydrique - eau (30.3.10) v/v/v.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Ampoule à décantation de 125 ml.

4.2. Bain d'eau bouillante.

4.3. Centrifugeuse équipée de pots de 50 ml.

4.4. Plaques de cellulose de dimensions 20 cm x 20 cm pour chromatographie en couche mince.

4.5. Deux cuves pour chromatographie ascendante pouvant contenir les plaques (4.4).

5. Mode opératoire.

5.1. Elimination de la pectine.

Placer 25 grammes de l'échantillon pour essai dans 50 ml d'éthanol (3.5).

Procéder à une agitation mécanique pendant au moins deux heures suivie d'un repos d'une nuit. Filtrer.

5.2. Isolement des anthocyanes.

5.2.1. Placer 30 ml de filtrat dans un pot de la centrifugeuse (4.3). Ajouter 10 ml de la solution d'acétate de plomb (3.8) et, goutte à goutte, l'hydroxyde d'ammonium (3.9) jusqu'à un pH voisin de 10, en agitant avec une baguette de verre.

5.2.2. Centrifuger. Rejeter le liquide, disperser le culot dans 10 ml d'éthanol (3.5). Centrifuger à nouveau. Rejeter le liquide et recommencer l'opération ci-dessus. Sécher les parois du pot au moyen de papier filtre.

5.2.3. Disperser le culot dans 5 ml de butanol - 1 (3.6) et ajouter, goutte à goutte, en agitant avec une baguette de verre, l'acide (3.2) jusqu'à ce que le précipité soit devenu complètement blanc. Centrifuger.

5.2.4. Verser le surnageant coloré obtenu en 5.2.3 dans l'ampoule (4.1). Ajouter 10 ml d'hexane (3.10). Agiter. Si la solution reste limpide, ajouter à nouveau de l'hexane par fractions de 10 ml en agitant après chaque addition. Dès que la solution se trouble, laisser se déposer les fines gouttelettes colorées qui renferment les anthocyanes. Recueillir dans un tube, après complète décantation, la couche inférieure dont une fraction sera réservée pour la chromatographie des anthocyanes en 7.1.1 et le reste utilisé pour la préparation des anthocyanidols en 5.3.1.

5.3 Préparation des anthocyanidols.

5.3.1. Extraire des anthocyanes restantes dans la phase supérieure (5.2.4) par 1 ml d'eau. Recueillir la couche inférieure colorée dans le tube utilisé en 5.2.4 et contenant le reste de la solution d'anthocyanes.

5.3.2. Ajouter un égal volume de la solution chlorhydrique (3.3). 5.3.3. Adapter au tube un petit réfrigérant à air et le porter dans le bain d'eau (4.2). Laisser l'hydrolyse se poursuivre pendant une heure.

5.3.4. Retirer le tube et le ramener à température ambiante par immersion dans l'eau froide.

5.3.5. Ajouter 0,5 ml de méthyl-3 butanol-1 (3.7). Agiter. Laisser décanter. Recueillir la phase supérieure qui renferme les anthocyanidols.

6. Préparation des solutions étalons.

6.1. Procéder comme en 5.1 et 5.2 pour préparer une solution d'anthocyanes d'identité connue à partir d'un jus de fruit authentique.

6.2. Procéder comme en 5.3 sur la solution d'anthocyanes (6.1) pour préparer la solution témoin d'anthocyanidols.

7. Chromatographie sur couche mince.

7.1. Anthocyanes.

7.1.1. Déposer sur une plaque (4.4) sous forme de traits de 1 cm de longueur et les plus fins possible, 10 à 40 ml de la solution obtenue en 5.2.4. Déposer à côté 10 ml de la solution d'anthocyanes obtenue en 6.1.

7.1.2. Introduire la plaque préparée en 7.1.1 dans une cuve (4.5) contenant de l'eau et laisser monter le front de l'eau jusqu'à une hauteur suffisante pour permettre une séparation ultérieure des anthocyanes. Laisser sécher à température ambiante.

7.1.3. Introduire la plaque traitée ci-dessus dans une cuve (4.5) contenant la solution (3.11.1) et laisser monter le front de l'éluant jusqu'à une hauteur suffisante pour permettre une bonne séparation des anthocyanes. Dans le cas d'anthocyanes à faible Rf, utiliser la solution (3.11.2).

7.1.4. Retirer alors la plaque développée en 7.1.3 et la laisser sécher à température ambiante sous une hotte ventilée jusqu'à disparition de l'odeur acide.

Les anthocyanes sont visibles sous forme de taches de couleur rouge et de nuances variables selon leur nature. Le rouge de betterave est isolé sous forme d'une tache pourpre qui migre au front de l'éluant lors du traitement à l'eau de la plaque en 7.1.2.

7.2. Anthocyanidols.

7.2.1. Déposer sur une plaque (4.4) sous forme de traits de 1 cm de longueur et les plus fins possible 10 à 40 ml de la solution obtenue en 5.3.5. Déposer à côté 10 ml de la solution d'anthocyanidols obtenue en 6.2.

7.2.2. Introduire la plaque préparée en 7.2.1 dans une cuve (4.5) contenant la solution (3.12) et laisser monter le front de l'éluant jusqu'à une hauteur suffisante pour permettre une bonne séparation des anthocyanidols.

7.2.3. Retirer alors la plaque développée en 7.2.2 et la laisser sécher à la température ambiante sous une hotte ventilée jusqu'à disparition de l'odeur d'acide.

Les anthocyanidols sont visibles sous forme de taches de couleur orange rouge ou violette selon leur nature.

1. Définition.

La teneur en D-sorbitol est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en milligramme pour 100 grammes.

2. Principe.

Oxydation du D-sorbitol par le sorbitol-déshydrogénase (SDH) en présence de nicotamide-adénine-dinucléotide (NAD +) qui est réduit en NADH.

Captation du NADH par l'iodonitrotétrazolium (INT) en présence de diaphorase.

Mesure de l'absorbance, à 492 nm, du formazan formé dans cette dernière réaction, proportionnellement à la quantité de D-sorbitol présent.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée récemment bouillie.

3.1. Réactifs spécifiques de l'analyse enzymatique (1) :

3.1.1. Flacon contenant environ 25 ml d'une solution à 2 p. 100 de triton R X 100 dans un tampon (phosphate de potassium-triéthanolamine) à pH 8,6.

3.1.2. Flacon contenant environ 100 mg de lyophilisat composé de 12 U de diaphorase de coeur de porc et 85 mg de b-NAD avec des stabilisateurs.

3.1.3. Flacon contenant 2,5 ml de solution de chlorure d'iodonitrotétrazolium.

3.1.4. Flacon contenant environ 110 mg de lyophilisat de SDH, soit 25 U.

3.2. Préparation des solutions :

3.2.1. Utiliser le contenu du flacon (3.1.1) sans dilution.

3.2.2. Dissoudre le contenu du flacon (3.1.2) avec 8 ml d'eau.

3.2.3. Diluer le contenu du flacon (3.1.3) avec 6 ml d'eau.

3.2.4. Dissoudre le contenu du flacon (3.1.4) avec 0,6 ml d'eau. Une légère opalescence de solution n'interfère pas dans la mesure.

(1) Tels que ceux contenus dans le coffret Boehringer, référence 670.057.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Micropipette, pointes usage unique.

4.2. Micropipette à capillaire ou équivalente.

4.3. Cuves à usage unique de 1 cm de parcours optique.

4.4. Spectrophotomètre.

5. Mode opératoire.

5.1. Mise en solution.

Peser à 1 cg près, environ 3 grammes d'échantillon pour essai et les introduire dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter 60 ml d'eau, laisser macérer une heure en agitant de temps en temps. Ajuster au trait de jauge, mélanger. Filtrer sur filtre plissé.

5.2. Détermination.

5.2.1. Introduire dans une cuve 4.3. :

- 0,6 ml de solution (3.2.1) (pipette 4.1) ;

- 0,2 ml de solution (3.2.2) (pipette 4.1) ;

- 0,2 ml de solution (3.2.3) (pipette 4.1) ;

- 1,9 ml d'eau (pipette 4.1) ;

- 0,1 ml de dilution (5.1) (pipette 4.2).

Mélanger et placer les cuves à l'obscurité. Attendre deux minutes.

Effectuer parallèlement la même opération dans une deuxième cuve en remplaçant la solution (5.1) par de l'eau. Soit, en tout, 2 ml d'eau.

Mesurer à 492 nm les absorbances respectives : AE et AT.

Attendre à nouveau deux minutes.

Mesurer à 492 nm les absorbances respectives : AE' et AT'.

Les variations d'absorbance ne doivent pas être supérieures à 0,002.

5.2.2. Ajouter dans chaque cuve : 0,05 ml de solution (3.2.4) (pipette 4.2).

Mélanger et placer les cuves à l'obscurité.

Attendre 45 minutes.

Mesurer à 492 nm les absorbances respectives.

Quinze minutes plus tard, procéder à une nouvelle mesure pour vérification.

Soient : AE2 et AT2 les maxima respectifs d'absorbance.

5.2.3. Déterminer les différences d'absorbance :

- de l'essai : DAE = (AE2 - AE') ;

- du témoin : DAT = (AT2 - AT'),

en déduire la différence d'absorption (essai-témoin) :

DA = DAE - DAT.

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule :

La teneur en sorbitol est donnée par la relation suivante :

D - sorbitol en mg % g = 279,2 m,

où :

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai (5.1) ;

D A est la différence d'absorbance déterminée en 5.2.3.

Cette formule étant une application de la relation générale suivante : V,

où :

V est le volume final, en millilitre, contenu dans la cuve, en 5.2.2 (3,05) ;

v est le volume, en millilitre, de solution (5.1) utilisée en 5.2.1 (0,1) ;

PM est la masse moléculaire du sorbitol (182,17) ;

d est le parcours optique, en centimètre, de la cuve 4.3 (1) ;

e est le coefficient d'absorption moléculaire du formazan 492 nm (19,9).

1. La prise d'essai peut être modifiée en fonction de la teneur du produit en sorbitol. Un rendement optimal est obtenu pour une quantité de sorbitol allant de 0,5 mg à 10 mg dans la cuve, soit 20 à 350 mg pour 100 grammes dans l'échantillon pour essai.

2. La méthode ci-dessus décrite détermine globalement le D - sorbitol et le xylitol éventuellement présent.

1. Définition.

L'acide sorbique est identifié et dosé par l'application de la méthode décrite ci-après.

La teneur en acide sorbique est exprimée en milligramme par kilogramme.

2. Principe.

Extraction de l'acide sorbique par l'isooctane en milieu acide. Spectrophotométrie d'absorption moléculaire en ultra-violet.

2.1. Identification.

Etablissement du spectre d'absorption entre 220 et 400 nm et comparaison avec un spectre réalisé à partir d'une solution aqueuse pure de sorbate de potassium.

2.2. Dosage.

Détermination de l'absorbance au maximum d'absorption et quantification à l'aide d'une courbe étalon établie à partir d'une solution de sorbate de potassium en milieu sucré.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

3.1. Isooctane (triméthyl-2,2,4 pentane) de qualité pour spectrophotométrie U.V.

3.2. Acide phosphorique r 20 = 1,70 g/ml.

3.3. Sorbate de potassium.

3.4. Saccharose.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Spectrophotomètre U.V.

4.2. Cuves de quartz de 1 cm de trajet optique.

4.3. Tubes cylindriques de 50 ml à bouchon vissant muni d'un joint téflon.

5. Mode opératoire.

5.1. Mise en solution.

Introduire une prise d'essai (E) de 15 grammes environ, pesée à 1 centigramme près, dans une fiole jaugée de 200 ml et ajouter 150 ml d'eau amenée à environ + 60 °C. Laisser macérer deux heures en agitant modérement.

Ajuster au trait de jauge. Mélanger. Filtrer sur filtre plissé. 5.2. Identification.

Conduire l'extraction comme indiqué en 5.3.2. et établir un spectre d'absorption de la phase organique en prenant l'isooctane (3.1) comme référence.

Comparer les caractéristiques de ce spectre à celles d'un spectre établi à partir d'une solution aqueuse pure de sorbate de potassium à 134 mg par litre, traitée dans les mêmes conditions.

5.3. Dosage.

5.3.1. Réalisation de la gamme-étalon :

a) Préparation de la solution-mère : dissoudre 134 mg, exactement pesés, de sorbate de potassium (correspondant à 100 mg d'acide sorbique) dans 100 ml de solution de saccharose d'une concentration calculée à partir de l'indice de réfraction déterminé par ailleurs ; b) Préparation des solutions-filles : introduire 2,5, 5 et 10 ml de solution mère dans, respectivement, trois fioles jaugées de 100 ml. Compléter au trait de jauge avec la solution de saccharose. Mélanger. Les concentrations respectives exprimées en acide sorbique des solutions filles sont : 25, 50 et 100 mg/litre (A1, A2 et A3). 5.3.2. Extraction.

Dans des tubes (4.3) distribuer les réactifs selon les indications du tableau 2. Ajouter deux billes de verre. Obturer et agiter énergiquement pendant deux minutes. Laisser reposer cinq minutes.

5.3.3. Construction de la courbe d'étalonnage. Porter en ordonnée les absorbances lues au maximum d'absorption pour A1, A2, A3 et en abscisse les teneurs correspondantes en acide sorbique en milligramme par litre.

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule.

La teneur en acide sorbique est donnée par la relation suivante :

Acide sorbique mg/kg = S. 200. 1 000E. 1 000 = S. 200E,

où :

E est la masse, en gramme, de la prise d'essai (5.1) ;

S est la concentration lue sur la courbe d'étalonnage pour le filtrat (5.1).

6.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement, l'une après l'autre, par le même analyste ne doit pas excéder 5 p. 100 en valeur relative.

Tableau n° 2 :

Volumes des réactifs, blanc A1, A2, A3 et filtrat.

Solution de saccharose (5.3.1) : 0,25 ml.

Solutions-filles de sorbate de potassium : 0,25 ml, 0,25 ml, 0,25 ml.

Filtrat (5.1) : 0,25 ml.

Acide phosphorique (3.2) : 0,1 ml, 0,1 ml, 0,1 ml, 0,1 ml, 0,1 ml.

Isooctane (3.1) : 10 ml, 10 ml, 10 ml, 10 ml, 10 ml.