1. Définition.

Les anthocyanes et le rouge de betterave sont les pigments naturels isolés et identifiés par l'application de la méthode décrite ci-après.

2. Principe.

Isolement des anthocyanes et du rouge de betterave à l'état de complexes avec le plomb, suivi d'extraction par le butanol - 1 et identification par chromatographie sur couche mince de cellulose.

Après hydrolyse des anthocyanes et extraction par le méthyl - 3 butanol - 1 des anthocyanidols libérés, identification de ceux-ci par chromatographie sur couche mince de cellulose.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

3.1. Acide acétique r20 = 1,05 g/ml.

3.2. Acide chlorhydrique r20 = 1,19 g/ml.

3.3. Solution d'acide chlorhydrique 2 M.

3.4. Acide formique r20 = 1,22 g/ml.

3.5. Ethanol à 80 p. 100 en volume.

3.6. Butanol - 1.

3.7. Méthyl - 3 butanol - 1.

3.8. Solution d'acétate de plomb Pb (CH3 COO)2, 3H2O à 80 grammes par litre.

3.9. Hydroxyde d'ammonium r20 = 0,90 g/ml.

3.10. Hexane.

3.11. Eluants des anthocyanes.

3.11.1. Acide formique - acide chlorhydrique - eau (1.4.8) v/v/v. 3.11.2. Butanol - 1 - acide chlorhydrique - eau (5.2.1) v/v/v.

3.12. Eluants des anthocyanidols.

Acide acétique - acide chlorhydrique - eau (30.3.10) v/v/v.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Ampoule à décantation de 125 ml.

4.2. Bain d'eau bouillante.

4.3. Centrifugeuse équipée de pots de 50 ml.

4.4. Plaques de cellulose de dimensions 20 cm x 20 cm pour chromatographie en couche mince.

4.5. Deux cuves pour chromatographie ascendante pouvant contenir les plaques (4.4).

5. Mode opératoire.

5.1. Elimination de la pectine.

Placer 25 grammes de l'échantillon pour essai dans 50 ml d'éthanol (3.5).

Procéder à une agitation mécanique pendant au moins deux heures suivie d'un repos d'une nuit. Filtrer.

5.2. Isolement des anthocyanes.

5.2.1. Placer 30 ml de filtrat dans un pot de la centrifugeuse (4.3). Ajouter 10 ml de la solution d'acétate de plomb (3.8) et, goutte à goutte, l'hydroxyde d'ammonium (3.9) jusqu'à un pH voisin de 10, en agitant avec une baguette de verre.

5.2.2. Centrifuger. Rejeter le liquide, disperser le culot dans 10 ml d'éthanol (3.5). Centrifuger à nouveau. Rejeter le liquide et recommencer l'opération ci-dessus. Sécher les parois du pot au moyen de papier filtre.

5.2.3. Disperser le culot dans 5 ml de butanol - 1 (3.6) et ajouter, goutte à goutte, en agitant avec une baguette de verre, l'acide (3.2) jusqu'à ce que le précipité soit devenu complètement blanc. Centrifuger.

5.2.4. Verser le surnageant coloré obtenu en 5.2.3 dans l'ampoule (4.1). Ajouter 10 ml d'hexane (3.10). Agiter. Si la solution reste limpide, ajouter à nouveau de l'hexane par fractions de 10 ml en agitant après chaque addition. Dès que la solution se trouble, laisser se déposer les fines gouttelettes colorées qui renferment les anthocyanes. Recueillir dans un tube, après complète décantation, la couche inférieure dont une fraction sera réservée pour la chromatographie des anthocyanes en 7.1.1 et le reste utilisé pour la préparation des anthocyanidols en 5.3.1.

5.3 Préparation des anthocyanidols.

5.3.1. Extraire des anthocyanes restantes dans la phase supérieure (5.2.4) par 1 ml d'eau. Recueillir la couche inférieure colorée dans le tube utilisé en 5.2.4 et contenant le reste de la solution d'anthocyanes.

5.3.2. Ajouter un égal volume de la solution chlorhydrique (3.3). 5.3.3. Adapter au tube un petit réfrigérant à air et le porter dans le bain d'eau (4.2). Laisser l'hydrolyse se poursuivre pendant une heure.

5.3.4. Retirer le tube et le ramener à température ambiante par immersion dans l'eau froide.

5.3.5. Ajouter 0,5 ml de méthyl-3 butanol-1 (3.7). Agiter. Laisser décanter. Recueillir la phase supérieure qui renferme les anthocyanidols.

6. Préparation des solutions étalons.

6.1. Procéder comme en 5.1 et 5.2 pour préparer une solution d'anthocyanes d'identité connue à partir d'un jus de fruit authentique.

6.2. Procéder comme en 5.3 sur la solution d'anthocyanes (6.1) pour préparer la solution témoin d'anthocyanidols.

7. Chromatographie sur couche mince.

7.1. Anthocyanes.

7.1.1. Déposer sur une plaque (4.4) sous forme de traits de 1 cm de longueur et les plus fins possible, 10 à 40 ml de la solution obtenue en 5.2.4. Déposer à côté 10 ml de la solution d'anthocyanes obtenue en 6.1.

7.1.2. Introduire la plaque préparée en 7.1.1 dans une cuve (4.5) contenant de l'eau et laisser monter le front de l'eau jusqu'à une hauteur suffisante pour permettre une séparation ultérieure des anthocyanes. Laisser sécher à température ambiante.

7.1.3. Introduire la plaque traitée ci-dessus dans une cuve (4.5) contenant la solution (3.11.1) et laisser monter le front de l'éluant jusqu'à une hauteur suffisante pour permettre une bonne séparation des anthocyanes. Dans le cas d'anthocyanes à faible Rf, utiliser la solution (3.11.2).

7.1.4. Retirer alors la plaque développée en 7.1.3 et la laisser sécher à température ambiante sous une hotte ventilée jusqu'à disparition de l'odeur acide.

Les anthocyanes sont visibles sous forme de taches de couleur rouge et de nuances variables selon leur nature. Le rouge de betterave est isolé sous forme d'une tache pourpre qui migre au front de l'éluant lors du traitement à l'eau de la plaque en 7.1.2.

7.2. Anthocyanidols.

7.2.1. Déposer sur une plaque (4.4) sous forme de traits de 1 cm de longueur et les plus fins possible 10 à 40 ml de la solution obtenue en 5.3.5. Déposer à côté 10 ml de la solution d'anthocyanidols obtenue en 6.2.

7.2.2. Introduire la plaque préparée en 7.2.1 dans une cuve (4.5) contenant la solution (3.12) et laisser monter le front de l'éluant jusqu'à une hauteur suffisante pour permettre une bonne séparation des anthocyanidols.

7.2.3. Retirer alors la plaque développée en 7.2.2 et la laisser sécher à la température ambiante sous une hotte ventilée jusqu'à disparition de l'odeur d'acide.

Les anthocyanidols sont visibles sous forme de taches de couleur orange rouge ou violette selon leur nature.