1. Définition.

La teneur en D-sorbitol est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en milligramme pour 100 grammes.

2. Principe.

Oxydation du D-sorbitol par le sorbitol-déshydrogénase (SDH) en présence de nicotamide-adénine-dinucléotide (NAD +) qui est réduit en NADH.

Captation du NADH par l'iodonitrotétrazolium (INT) en présence de diaphorase.

Mesure de l'absorbance, à 492 nm, du formazan formé dans cette dernière réaction, proportionnellement à la quantité de D-sorbitol présent.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée récemment bouillie.

3.1. Réactifs spécifiques de l'analyse enzymatique (1) :

3.1.1. Flacon contenant environ 25 ml d'une solution à 2 p. 100 de triton R X 100 dans un tampon (phosphate de potassium-triéthanolamine) à pH 8,6.

3.1.2. Flacon contenant environ 100 mg de lyophilisat composé de 12 U de diaphorase de coeur de porc et 85 mg de b-NAD avec des stabilisateurs.

3.1.3. Flacon contenant 2,5 ml de solution de chlorure d'iodonitrotétrazolium.

3.1.4. Flacon contenant environ 110 mg de lyophilisat de SDH, soit 25 U.

3.2. Préparation des solutions :

3.2.1. Utiliser le contenu du flacon (3.1.1) sans dilution.

3.2.2. Dissoudre le contenu du flacon (3.1.2) avec 8 ml d'eau.

3.2.3. Diluer le contenu du flacon (3.1.3) avec 6 ml d'eau.

3.2.4. Dissoudre le contenu du flacon (3.1.4) avec 0,6 ml d'eau. Une légère opalescence de solution n'interfère pas dans la mesure.

(1) Tels que ceux contenus dans le coffret Boehringer, référence 670.057.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Micropipette, pointes usage unique.

4.2. Micropipette à capillaire ou équivalente.

4.3. Cuves à usage unique de 1 cm de parcours optique.

4.4. Spectrophotomètre.

5. Mode opératoire.

5.1. Mise en solution.

Peser à 1 cg près, environ 3 grammes d'échantillon pour essai et les introduire dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter 60 ml d'eau, laisser macérer une heure en agitant de temps en temps. Ajuster au trait de jauge, mélanger. Filtrer sur filtre plissé.

5.2. Détermination.

5.2.1. Introduire dans une cuve 4.3. :

- 0,6 ml de solution (3.2.1) (pipette 4.1) ;

- 0,2 ml de solution (3.2.2) (pipette 4.1) ;

- 0,2 ml de solution (3.2.3) (pipette 4.1) ;

- 1,9 ml d'eau (pipette 4.1) ;

- 0,1 ml de dilution (5.1) (pipette 4.2).

Mélanger et placer les cuves à l'obscurité. Attendre deux minutes.

Effectuer parallèlement la même opération dans une deuxième cuve en remplaçant la solution (5.1) par de l'eau. Soit, en tout, 2 ml d'eau.

Mesurer à 492 nm les absorbances respectives : AE et AT.

Attendre à nouveau deux minutes.

Mesurer à 492 nm les absorbances respectives : AE' et AT'.

Les variations d'absorbance ne doivent pas être supérieures à 0,002.

5.2.2. Ajouter dans chaque cuve : 0,05 ml de solution (3.2.4) (pipette 4.2).

Mélanger et placer les cuves à l'obscurité.

Attendre 45 minutes.

Mesurer à 492 nm les absorbances respectives.

Quinze minutes plus tard, procéder à une nouvelle mesure pour vérification.

Soient : AE2 et AT2 les maxima respectifs d'absorbance.

5.2.3. Déterminer les différences d'absorbance :

- de l'essai : DAE = (AE2 - AE') ;

- du témoin : DAT = (AT2 - AT'),

en déduire la différence d'absorption (essai-témoin) :

DA = DAE - DAT.

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule :

La teneur en sorbitol est donnée par la relation suivante :

D - sorbitol en mg % g = 279,2 m,

où :

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai (5.1) ;

D A est la différence d'absorbance déterminée en 5.2.3.

Cette formule étant une application de la relation générale suivante : V,

où :

V est le volume final, en millilitre, contenu dans la cuve, en 5.2.2 (3,05) ;

v est le volume, en millilitre, de solution (5.1) utilisée en 5.2.1 (0,1) ;

PM est la masse moléculaire du sorbitol (182,17) ;

d est le parcours optique, en centimètre, de la cuve 4.3 (1) ;

e est le coefficient d'absorption moléculaire du formazan 492 nm (19,9).

1. La prise d'essai peut être modifiée en fonction de la teneur du produit en sorbitol. Un rendement optimal est obtenu pour une quantité de sorbitol allant de 0,5 mg à 10 mg dans la cuve, soit 20 à 350 mg pour 100 grammes dans l'échantillon pour essai.

2. La méthode ci-dessus décrite détermine globalement le D - sorbitol et le xylitol éventuellement présent.