Art. 1er. - Il est porté additions à la dixième édition de la Pharmacopée française pour les monographies et les méthodes générales:

DOXORUBICINE (CHLORHYDRATE DE)

Doxorubicini hydrochloridum

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Vous pouvez consulter le tableau dans le JO no 0146 du 25/06/94 Page 9191 a 9199
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C27H30ClNO11

Mr 580,0

Le chlorhydrate de doxorubicine est le chlorhydrate d'une substance élaborée par certaines souches de Streptomyces coeruleorubidus ou de Streptomyces peucetius ou obtenue par tout autre moyen. Il contient au minimum 98,0 p. 100 et au maximum l'équivalent de 102,0 p. 100 de chlorhydrate de (8S,10S)-10-[(3-amino-2,3,6-tridésoxy-!-L-lyxo-hexopyrannosyl) oxy]-6,8,
11-trihydroxy-8- (hydroxyacétyl) -1-méthoxy-7,8, 9,
10-tétrahydronaphtacène-5, 12-dione, calculé par rapport à la substance anhydre et exempte de solvant.

Caractères

Poudre cristalline, rouge orangé, hygroscopique, soluble dans l'eau, peu soluble dans le méthanol, pratiquement insoluble dans le chloroforme.

Identification

Les identifications A et C peuvent être omises quand les identifications B et D sont effectuées. L'identification B peut être omise quand les identifications A, C et D sont effectuées.
A. - Dissolvez 1 mg de chlorhydrate de doxorubicine dans de l'alcool R et complétez à 100 ml avec le même solvant. Examinée de 220 nm à 550 nm (V.6.19), la solution présente 6 maximums d'absorption respectivement à 234 nm, 252 nm, 288 nm, 475 nm, 495 nm et 530 nm.
B. - Examinez le chlorhydrate de doxorubicine par spectrophotométrie d'absorption dans l'infrarouge (V.6.18). Les maximums d'absorption du spectre obtenu avec la substance à examiner correspondent en position et en intensité relative à ceux du spectre obtenu avec le chlorhydrate de doxorubicine SCR.
C. - Examinez les chromatogrammes obtenus dans l'essai < < Substances apparentées > >. La tache principale du chromatogramme obtenu avec la solution à examiner (b) est semblable quant à sa position, sa coloration et ses dimensions à la tache principale du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a) et diffère quant à sa position de la tache principale du chromatogramme obtenu avec la solution témoin b.
D. - Dissolvez 10 mg environ de chlorhydrate de doxorubicine dans 0,5 ml d'acide nitrique R, ajoutez 0,5 ml d'eau et chauffez sur une flamme pendant deux minutes. Laissez refroidir, puis ajoutez 0,5 ml de solution de nitrate d'argent R1. Il se forme un précipité blanc.

Essai

Détermination du pH (V.6.3.1). Dissolvez 50 mg de chlorhydrate de doxorubicine dans de l'eau exempte de dioxyde de carbone R et complétez à 10 ml avec le même solvant. Le pH de la solution est de 4,0 à 5,5.
Substances apparentées. Opérez par chromatographie sur couche mince (V.6.20.2) en utilisant une plaque recouverte de gel de silice H R.
Solution à examiner (a). Dissolvez 50 mg de chlorhydrate de doxorubicine dans 1 ml d'eau et complétez à 5 ml avec du méthanol R.
Solution à examiner (b). Prélevez 1 ml de solution à examiner (a) et complétez à 5 ml avec un mélange de 10 volumes d'eau et de 90 volumes de méthanol R.
Solution témoin (a). Dissolvez 10 mg de chlorhydrate de doxorubicine SCR dans un mélange de 10 volumes d'eau et de 90 volumes de méthanol R et complétez à 5 ml avec le même mélange de solvants.
Solution témoin (b). Dissolvez 10 mg de chlorhydrate de daunorubicine SCR dans un mélange de 10 volumes d'eau et de 90 volumes de méthanol R et complétez à 5 ml avec le même mélange de solvants.
Solution témoin (c). Dissolvez 5 mg d'aglycone de doxorubicine SCR (doxorubicinone) dans du chlorure de méthylène R et complétez à 100 ml avec le même solvant.
Solution témoin (d). Prélevez 1 ml de solution témoin (a) et complétez à 40 ml avec du méthanol R.
Déposez séparément sur la plaque, en bandes de 5 mm, 10 ,l de chaque solution. Développez dans une cuve non saturée, sur un parcours de 15 cm,
avec un mélange de 1 volume d'eau, de 2 volumes d'acide formique anhydre R,
de 15 volumes de méthanol R et de 82 volumes de chlorure de méthylène R.
Laissez sécher la plaque à l'air et examinez immédiatement. S'il apparaît une tache correspondant à l'aglycone de doxorubicine dans le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner (a), elle n'est pas plus intense que la tache principale du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (c). S'il apparaît d'autres taches que la tache principale et les taches correspondant à l'aglycone de doxorubicine dans le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner (a), aucune d'entre elles n'est plus intense que la tache principale du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (d).
Acétone et éthanol. Opérez par chromatographie en phase gazeuse (V.6.20.3) en utilisant le dioxanne R comme étalon interne.
Solution à examiner. Dissolvez 50 mg de chlorhydrate de doxorubicine dans 1,0 ml d'eau contenant 0,1 p. 100 m/V de dioxanne R.
Solution témoin. Mélangez 0,50 g d'éthanol R, 0,50 g d'acétone R et 1,00 g de dioxanne R et complétez à 100 ml avec de l'eau. Prélevez 10 ml de cette solution et complétez à 100 ml avec de l'eau.
La chromatographie peut être effectuée en utilisant :
- une colonne de verre d'une longueur de 2 m et d'un diamètre intérieur de 3 mm, remplie de terre d'infusoires pour chromatographie R1, imprégnée de 10 p. 100 m/m de polyéthylèneglycol 20 000 R;
- comme gaz vecteur de l'azote pour chromatographie R;
- un détecteur à ionisation de flamme,
en maintenant la température de la colonne à 70 oC, celle de la chambre à injection et celle du détecteur à 125 oC.
- Injectez 1 ,l de chaque solution.
La teneur totale en acétone et en éthanol n'est pas supérieure à 2,0 p. 100 m/m, dont 0,5 p. 100 d'acétone au maximum.
Teneur en eau (V.3.5.6). Déterminée par semi-microdosage sur 0,100 g de chlorhydrate de doxorubicine, la teneur en eau n'est pas supérieure à 4,0 p. 100.
Histamine (V.2.1.6). Effectuez l'essai de façon que la concentration en chlorhydrate de doxorubicine dans le bain à organes ne dépasse pas 100 mg par litre. Le chlorhydrate de doxorubicine ne contient pas plus de 100 ,g de substances histaminiques (calculées en dichlorhydrate d'histamine) par gramme.

Dosage

Opérez par chromatographie liquide (V.6.20.4).
Solution à examiner. Dissolvez 50,0 mg de chlorhydrate de doxorubicine dans la phase mobile et complétez à 100,0 ml avec la phase mobile.
Solution témoin (a). Dissolvez 50,0 mg de chlorhydrate de doxorubicine SCR dans la phase mobile et complétez à 100,0 ml avec la phase mobile.
Solution témoin (b). Dissolvez 10,0 mg de chlorhydrate de doxorubicine SCR et 10 mg de chlorhydrate d'épirubicine SCR dans la phase mobile et complétez à 50 ml avec la phase mobile. Prélevez 10,0 ml de cette solution et complétez à 100,0 ml avec la phase mobile.
La chromatographie peut être réalisée en utilisant :
- une colonne d'une longueur de 0,15 m et d'un diamètre intérieur de 4,6 mm, remplie de gel de silice octadécylsilylé pour chromatographie R (5 ,m);
- comme phase mobile, à un débit de 0,8 ml par minute, un mélange de 5 volumes de méthanol R1, de 45 volumes d'acétonitrile R et de 50 volumes d'une solution contenant 0,288 p. 100 m/V de laurylsulfate de sodium R et 0,230 p. 100 m/V d'acide phosphorique R;
- comme détecteur, un spectrophotomètre réglé à 254 nm.
Injectez à 6 reprises 20 ,l de solution témoin (b). L'essai n'est valable que si:
- la résolution entre les pics correspondant respectivement à la doxorubicine et à l'épirubicine n'est pas inférieure à 2,0,
- l'écart type relatif de la surface du pic de la doxorubicine n'est pas supérieure à 1,0 p. 100.
Si nécessaire, ajustez les conditions opératoires. Injectez 20 ,l de solution à examiner et 20 ,l de solution témoin (a) et calculez la teneur pour cent en C27H30ClNO11.
Le chlorhydrate de doxorubicine destiné à la préparation de formes pharmaceutiques administrées par voie parentérale, sans autre procédé approprié de stérilisation, satisfait également à l'essai suivant:
Stérilité (V.2.1.1).
Le chlorhydrate de doxorubicine destiné à la préparation de formes pharmaceutiques administrées par voie parentérale sans autre procédé approprié d'élimination des pyrogènes satisfait également à l'essai suivant: Endotoxines bactériennes (V.2.1.9). La concentration maximale permise en endotoxines est de 2,2 U.I. par milligramme.

Conservation

En récipient étanche. Si la substance est stérile, elle est conservée en récipient stérile, étanche, à fermeture inviolable.

Etiquetage

L'étiquette indique:
- dans les cas appropriés, que la substance est stérile;
- dans les cas appropriés, que la substance est exempte d'endotoxines bactériennes.

VII.1.1. REACTIFS

Méthanol R 1. Le méthanol R 1 satisfait aux exigences de la rubrique Méthanol R et à l'exigence supplémentaire suivante:
Transmittance minimale (V.6.19):
20 p. 100 à 210 nm;
50 p. 100 à 220 nm;
75 p. 100 à 230 nm;
95 p. 100 à 250 nm;
98 p. 100 à 260 nm et plus,
l'eau étant utilisée comme liquide de compensation.

IMMUNOGLOBULINE HUMAINE NORMALE

Immunoglobulinum humanum normale

Définition

L'immunoglobuline humaine normale est une préparation liquide ou cryodesséchée contenant des immunoglobulines, principalement l'immunoglobuline G (IgG). D'autres protéines peuvent être présentes.
L'immunoglobuline humaine normale contient les anticorps IgG de sujets normaux. La préparation est destinée à être administrée par voie intramusculaire.
L'immunoglobuline humaine normale est obtenue à partir de plasma qui est conforme aux exigences de la monographie Plasma humanum ad separationem.
Aucun antibiotique n'est ajouté au plasma utilisé.

Production

La méthode de préparation comprend une ou plusieurs étapes dont il a été démontré qu'elles éliminent ou inactivent les agents connus d'infection ; il doit être démontré que, dans le produit fini, les résidus de substances éventuellement utilisées pour l'inactivation des virus n'ont aucun effet indésirable sur les patients traités avec l'immunoglobuline.
L'innocuité de la préparation lors de l'administration par voie intramusculaire aura été démontrée par des essais appropriés sur animaux et par une étude pendant les essais cliniques.
Elle est préparée à partir du produit recueilli chez 1 000 donneurs au minimum, selon une méthode dont il a été démontré qu'elle permet d'obtenir un produit qui :
- ne transmet pas d'infection;
- à une concentration protéique de 16 p. 100 m/V, contient, parmi les anticorps 2 au moins (l'un viral et l'autre bactérien) pour lesquels un étalon international ou une préparation de référence existe. La concentration de ces anticorps est au moins 10 fois supérieure à celle de la matière première initiale.
L'immunoglobuline humaine normale est préparée sous forme de solution stabilisée, par exemple dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 p. 100 m/V, dans une solution de glycine à 2,25 p. 100 m/V ou, si la préparation doit être cryodesséchée, dans une solution de glycine à 6 p. 100 m/V. Les préparations présentées en récipients multidoses contiennent un conservateur antimicrobien. Les préparations présentées en récipients unidoses ne contiennent pas de conservateur antimicrobien. Les agents antimicrobiens et les stabilisants éventuellement utilisés doivent être reconnus comme n'ayant pas, à la concentration utilisée, d'effets nuisibles sur le produit final. La solution est filtrée sur une membrane retenant les bactéries.
La stabilité du produit est démontrée par des essais effectués pendant les études de développement.

Caractères

La préparation liquide est limpide, jaune pâle à brun clair. Au cours de la conservation, un léger trouble ou quelques particules peuvent apparaître. La préparation cryodesséchée est une poudre blanche, faiblement jaunâtre ou une masse solide et friable.
Dans le cas d'une préparation cryodesséchée, reconstituez-la d'après les indications de l'étiquette immédiatement avant d'effectuer l'identification et les essais, sauf ceux de solubilité et de la teneur en eau.

Identification

A. - Effectuez sur l'immunoglobuline humaine normale des essais de précipitation avec une gamme appropriée d'immunosérums spécifiques d'espèces (1). L'immunoglobuline humaine normale contient des protéines d'origine humaine et donne des résultats négatifs avec les immunosérums spécifiques des protéines plasmatiques d'autres espèces.
B. - Examinez l'immunoglobuline humaine normale par une technique appropriée d'immunoélectrophorèse. A l'aide d'un immunosérum du sérum humain normal,
comparez un sérum humain normal et l'immunoglobuline humaine normale, dilués à une concentration de 1 p. 100 m/V en protéines. Le composant principal de l'immunoglobuline humaine normale correspond au composant IgG du sérum humain normal. D'autres protéines plasmatiques peuvent être présentes en faibles quantités dans l'immunoglobuline.

Essai

Solubilité. Dans le cas d'une préparation cryodesséchée, ajoutez le volume du liquide indiqué sur l'étiquette. La préparation se dissout complètement en 20 minutes à 20-25 oC.
Détermination du pH (V.6.3.1). Diluez l'immunoglobuline humaine normale dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration de 1 p. 100 m/V en protéines. Le pH de la solution est de 6,4 à 7,2.
Protéines totales. Diluez l'immunoglobuline humaine normale dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V pour obtenir une solution contenant 15 mg environ de protéines dans 2 ml. Dans un tube à centrifugation à fond rond, introduisez 2 ml de cette solution. Ajoutez 2 ml d'une solution de molybdate de sodium R à 7,5 p. 100 m/V et 2 ml d'un mélange de 1 volume d'acide sulfurique exempt d'azote R et de 30 volumes d'eau. Agitez,
centrifugez pendant 5 minutes, décantez le liquide surnageant et laissez égoutter le tube renversé sur du papier filtre. Effectuez le dosage de l'azote dans le culot après minéralisation par l'acide sulfurique (V.3.5.2). Calculez la teneur en protéines en multipliant la quantité d'azote par 6,25. La teneur en protéines n'est pas inférieure à 10 p. 100 m/V ni supérieure à 18 p. 100 m/V. Elle n'est pas inférieure à 90 p. 100 ni supérieure à 110 p.
100 de la quantité indiquée sur l'étiquette.
Composition en protéines. Opérez par électrophorèse de zone (V.6.21) en utilisant comme support des bandelettes de gel d'acétate de cellulose approprié et comme solution d'électrolyte la solution tampon barbital pH 8,6 R1.
Solution à examiner. Diluez l'immunoglobuline humaine normale dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration de 5 p. 100 m/V en protéines.
Solution témoin. Reconstituez l'immunoglobuline humaine pour électrophorèse PBR et diluez-la dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration de 5 p. 100 m/V en protéines.
Déposez sur une bandelette 2,5 ,l de solution à examiner en bande de 10 mm ou déposez 0,25 ,l par millimètre si une bandelette plus étroite est utilisée. Sur une autre bandelette, déposez dans les mêmes conditions le même volume de solution témoin. Appliquez un champ électrique approprié tel que la bande de l'albumine du sérum humain normal dans un électrophorégramme témoin migre de 30 mm au moins. Traitez les bandelettes avec de la solution de noir amido 10B R pendant 5 minutes, puis avec un mélange de 10 volumes d'acide acétique glacial R et de 90 volumes de méthanol R pendant le temps strictement nécessaire pour obtenir la décoloration du support. Développez la transparence du support avec un mélange de 19 volumes d'acide acétique glacial R et de 81 volumes de méthanol R. Mesurez l'absorbance des bandes à 600 nm à l'aide d'un instrument ayant à cette longueur d'onde une réponse linéaire sur l'intervalle de mesure. Effectuez 3 fois la mesure sur chaque bandelette et calculez la moyenne des lectures sur chaque bandelette. Dans l'électrophorégramme obtenu avec la solution à examiner, 10 p. 100 au plus des protéines ont une mobilité différente de celle de la bande principale.
L'essai n'est valable que si, dans l'électrophorégramme obtenu avec la solution témoin, la proportion de protéines contenues dans la bande principale est dans les limites indiquées dans la notice accompagnant la préparation de référence.
Distribution de la taille moléculaire. Examinez par chromatographie liquide (V.6.20.4).
Solution à examiner. Diluez la préparation à examiner dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration appropriée au système chromatographique utilisé. Une concentration entre 4 g/l et 12 g/l et l'injection de 50 ,g à 600 ,g de protéine conviennent généralement.
Solution témoin. Diluez l'immunoglobuline humaine PBR dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V pour obtenir la même concentration en protéines que dans la solution à examiner.
La chromatographie peut être réalisée en utilisant :
- une colonne d'une longueur de 0,6 m et d'un diamètre intérieur de 7,5 mm, remplie de gel de silice hydrophile pour chromatographie R;
- comme phase mobile, à un débit de 0,5 ml par minute, une solution contenant par litre : 4,873 g de phosphate disodique dihydraté R, 1,741 g de phosphate monosodique monohydraté R, 11,688 g de chlorure de sodium R et 50 mg d'azide de sodium R;
- comme détecteur, un spectrophotomètre réglé à 280 nm.
Dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin, le pic principal correspond à l'IgG monomère et il apparaît un pic correspondant au dimère à un temps de rétention relatif au monomère de 0,85 environ. Identifiez les pics dans le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner par comparaison au chromatogramme obtenu avec la solution témoin ; les pics ayant un temps de rétention plus petit que celui du dimère correspondent aux polymères et aux agrégats. La préparation à examiner satisfait à l'essai si dans le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner :
- le temps de rétention par rapport au pic correspondant dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin est de 1 0,02 pour le monomère et pour le dimère;
- la somme du monomère et du dimère représente 85 p. 100 au minimum de la surface totale du chromatogramme et les polymères et agrégats représentent 10 p. 100 au maximum de la surface totale.
Teneur en eau (V.3.5.6). Déterminée par semi-microdosage sur 0,500 g d'immunoglobuline humaine normale, la teneur en eau d'une préparation cryodesséchée n'est pas supérieure à 3,0 p. 100.
Stérilité (V.2.1.1). L'immunoglobuline humaine normale satisfait à l'essai de stérilité.
Pyrogènes (V.2.1.4). L'immunoglobuline humaine normale satisfait à l'essai des pyrogènes. Injectez à chaque lapin, par kilogramme de masse corporelle, 1 ml de la préparation à examiner.
Anticorps contre l'antigène de surface de l'hépatite B. Le taux d'anticorps contre l'antigène de surface de l'hépatite B de l'immunoglobuline humaine normale, déterminé par une méthode immunochimique appropriée (V.2.1.10),
n'est pas inférieur à 0,5 U.I. par gramme d'immunoglobuline.
L'immunoglobuline humaine normale destinée à être utilisée dans la prophylaxie de l'hépatite A satisfait également à l'essai suivant :
Anticorps contre le virus de l'hépatite A. Déterminez le taux d'anticorps contre le virus de l'hépatite A par comparaison avec une préparation de référence étalonnée en unités internationales, à l'aide d'un immunodosage de sensibilité et de spécificité appropriées (V.2.1.10).
L'unité internationale correspond à l'activité d'une quantité donnée de la préparation de référence internationale (2) d'immunoglobuline de l'hépatite A.
L'activité indiquée n'est pas inférieure à 100 U.I. par millilitre.
L'activité mesurée n'est pas inférieure à l'activité indiquée. Les limites de confiance (P = 0,95) de l'activité mesurée ne sont pas inférieures à 80 p.
100 ni supérieures à 125 p. 100.

Conservation

Conservez la préparation liquide en récipient de verre incolore, à l'abri de la lumière. Conservez la préparation cryodesséchée en récipient de verre incolore, sous vide ou sous un gaz inerte, à l'abri de la lumière.

Etiquetage

L'étiquette du récipient et celle de l'emballage indiquent:
- dans le cas d'un produit liquide, le volume de préparation dans le récipient et la teneur en protéines exprimée en grammes par litre;
- dans le cas d'un produit cryodesséché, la quantité de protéines dans le récipient;
- la voie d'administration;
- les conditions de conservation;
- la date de péremption.
L'étiquette de l'emballage ou la notice jointe indiquent:
- dans le cas du produit cryodesséché, le nom ou la composition et le volume du liquide à ajouter;
- dans les cas appropriés, que la préparation convient à la prophylaxie de l'hépatite A;
- dans les cas appropriés, l'activité antihépatite A en unités internationales par millilitre;
- dans les cas appropriés, le nom et la quantité du conservateur antimicrobien présent dans la préparation.

VII.1.1. REACTIFS

Phosphate disodique dihydraté. Voir la monographie Dinatrii phosphas dihydricus.
Phosphate monosodique monohydraté. NaH2PO4, H2O (Mr 138,0).
Silice (gel de) hydrophile pour chromatographie. Gel de silice de granulométrie très fine (3-10 ,m) et dont la surface a été traitée afin de la rendre hydrophile. La taille des particules peut être indiquée après le nom du réactif dans les essais où il est utilisé.
Poudre blanche, fine, homogène, pratiquement insoluble dans l'eau, dans l'alcool et dans le chloroforme.

IMMUNOGLOBULINE HUMAINE NORMALE

POUR ADMINISTRATION PAR VOIE INTRAVEINEUSE

Immunoglobulinum humanum normale ad usum intravenosum

Définition

L'immunoglobuline humaine normale pour administration par voie intraveineuse est une préparation liquide ou cryodesséchée contenant des immunoglobulines, principalement de l'immunoglobuline G (IgG). D'autres protéines peuvent être présentes. L'immunoglobuline humaine normale pour administration par voie intraveineuse contient les anticorps IgG de sujets normaux. Cette monographie ne s'applique pas aux préparations fabriquées par un procédé qui a pour but de donner une préparation contenant des fragments ou chimiquement modifiée.
L'immunoglobuline humaine normale pour administration par voie intraveineuse est obtenue à partir de plasma qui est conforme aux exigences de la monographie Plasma humanum ad separationem. Aucun antibiotique n'est ajouté au plasma utilisé.

Production

La méthode de préparation comprend une ou plusieurs étapes dont il a été démontré qu'elles éliminent ou inactivent les agents connus d'infection; il doit être démontré que, dans le produit fini, les résidus de substances éventuellement utilisées pour l'inactivation des virus n'ont aucun effet indésirable sur les patients traités avec l'immunoglobuline.
L'innocuité de la préparation lors de l'administration par voie intraveineuse aura été démontrée par des essais appropriés sur animaux et par une étude pendant les essais cliniques.
Elle est préparée à partir du produit recueilli chez 1 000 donneurs au minimum, selon une méthode dont il a été démontré qu'elle permet d'obtenir un produit qui:
- ne transmet pas d'infection;
- à une concentration en immunoglobuline de 5 p. 100 m/V, contient parmi les anticorps 2 au moins (l'un viral et l'autre bactérien) pour lesquels un étalon international ou une préparation de référence existe. La concentration de ces anticorps est au moins 3 fois supérieure à celle de la matière première initiale;
- a une distribution définie en sous-classes d'immunoglobuline G;
- satisfait à l'essai de fonction Fc (V.2.2.10).
L'immunoglobuline humaine normale pour administration par voie intraveineuse est préparée soit sous forme de solution stabilisée, soit cryodesséchée. Un stabilisant peut être ajouté. Dans les deux cas, la préparation est filtrée sur une membrane retenant les bactéries. Aucun conservateur antimicrobien n'est ajouté, ni pendant le fractionnement ni à la solution finale en vrac.
La stabilité du produit est démontrée par des essais effectués pendant les études de développement.

Caractères

La préparation liquide est limpide ou faiblement opalescente et incolore ou jaune pâle. La préparation cryodesséchée est une poudre blanche ou faiblement jaunâtre ou une masse solide et friable.
Dans le cas d'une préparation cryodesséchée, reconstituez-la d'après les indications de l'étiquette immédiatement avant d'effectuer l'identification et les essais, sauf ceux de la solubilité et de la teneur en eau.

Identification

A. - Effectuez sur la préparation à examiner des essais de précipitation avec une gamme appropriée d'immunosérums spécifiques d'espèces (1). La préparation à examiner contient des protéines d'origine humaine et donne des résultats négatifs avec les immunosérums spécifiques des protéines plasmatiques d'autres espèces.
B. - Examinez la préparation par une technique appropriée d'immunoélectrophorèse. A l'aide d'un immunosérum du sérum humain normal,
comparez un sérum humain normal et la préparation à examiner, dilués à une concentration de 1 p. 100 m/V en protéines. Le composant principal de la préparation à examiner correspond au composant IgG du sérum humain normal.
D'autres protéines plasmatiques peuvent être présentes en faibles quantités dans la préparation à examiner; si l'albumine humaine a été ajoutée en tant que stabilisant, elle peut être visible comme un composant important.

Essai

Solubilité. Dans le cas d'une préparation cryodesséchée, ajoutez le volume du liquide indiqué sur l'étiquette. La préparation se dissout complètement en 30 min à 20-25 oC.
Détermination du pH (V.6.3.1). Diluez la préparation à examiner dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration de 1 p. 100 m/V en protéines. Le pH de la solution est de 4,0 à 7,4.
Osmolalité (V.6.25). L'osmolalité de la préparation à examiner n'est pas inférieure à 240 mosmol/kg.
Protéines totales. Diluez la préparation à examiner dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V pour obtenir une solution contenant 15 mg environ de protéines dans 2 ml. Dans un tube à centrifugation à fond rond, introduisez 2,0 ml de cette solution. Ajoutez 2 ml d'une solution de molybdate de sodium R à 7,5 p. 100 m/V et 2 ml d'un mélange de 1 volume d'acide sulfurique exempt d'azote R et de 30 volumes d'eau. Agitez,
centrifugez pendant 5 minutes, décantez le liquide surnageant et laissez égoutter le tube renversé sur du papier filtre. Effectuez le dosage de l'azote dans le culot après minéralisation par l'acide sulfurique (V.3.5.2). Calculez la teneur en protéines en multipliant la quantité d'azote par 6,25. La teneur en protéines n'est pas inférieure à 3 p. 100 m/V. Elle n'est pas inférieure à 90 p. 100 ni supérieure à 110 p. 100 de la quantité indiquée sur l'étiquette.
Composition en protéines. Opérez par électrophorèse de zone (V.6.21) en utilisant comme support des bandelettes de gel d'acétate de cellulose approprié et comme solution d'électrolyte la solution tampon barbital pH 8,6 R1.
Solution à examiner. Diluez la préparation à examiner dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration de 3 p. 100 m/V en immunoglobuline.
Solution témoin. Reconstituez l'immunoglobuline humaine pour électrophorèse PBR et diluez-la dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration de 3 p. 100 m/V en protéines.
Déposez sur une bandelette 4,0 ,l de solution à examiner en bande de 10 mm ou déposez 0,4 ,l par millimètre si une bandelette plus étroite est utilisée. Sur une autre bandelette, déposez dans les mêmes conditions le même volume de solution témoin. Appliquez un champ électrique approprié tel que la bande de l'albumine du sérum humain normal dans un électrophorégramme témoin migre de 30 mm au moins. Traitez les bandelettes avec de la solution de noir amido 10B R pendant 5 minutes, puis avec un mélange de 10 volumes d'acide acétique glacial R et de 90 volumes de méthanol R pendant le temps strictement nécessaire pour obtenir la décoloration du support. Développez la transparence du support avec un mélange de 19 volumes d'acide acétique glacial R et de 81 volumes de méthanol R. Mesurez l'absorbance des bandes à 600 nm à l'aide d'un instrument ayant à cette longueur d'onde une réponse linéaire sur l'intervalle à examiner. Effectuez 3 fois la mesure sur chaque bandelette et calculez la moyenne des lectures sur chaque bandelette. Dans l'électrophorégramme obtenu avec la solution à examiner, 5 p. 100 au plus des protéines ont une mobilité différente de celle de la bande principale. Cette limite ne s'applique pas si l'albumine a été ajoutée à la préparation comme stabilisant ; dans le cas des préparations stabilisées par l'albumine, un essai de composition en protéines est effectué pendant la fabrication avant l'addition du stabilisant. L'essai n'est valable que si, dans l'électrophorégramme obtenu avec la solution témoin, la proportion de protéines contenues dans la bande principale est dans les limites indiquées dans la notice accompagnant la préparation de référence.
Distribution de la taille moléculaire. Examinez par chromatographie liquide (V.6.20.4).
Solution à examiner. Diluez la préparation à examiner dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V jusqu'à une concentration appropriée au système chromatographique utilisé. Une concentration entre 4 g/l et 12 g/l et l'injection de 50 ,g à 600 ,g de protéine conviennent généralement.
Solution témoin. Diluez l'immunoglobuline humaine PBR dans une solution de chlorure de sodium R à 0,9 p. 100 m/V pour obtenir la même concentration en protéines que dans la solution à examiner.
La chromatographie peut être réalisée en utilisant :
- une colonne d'une longueur de 0,6 m et d'un diamètre intérieur de 7,5 mm, remplie de gel de silice hydrophile pour chromatographie R;
- comme phase mobile, à un débit de 0,5 ml par minute, une solution contenant par litre : 4,873 g de phosphate disodique dihydraté R, 1,741 g de phosphate monosodique monohydraté R, 11,688 g de chlorure de sodium R et 50 mg d'azide de sodium R;
- comme détecteur, un spectrophotomètre réglé à 280 nm.
Dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin, le pic principal correspond à l'IgG monomère et il apparaît un pic correspondant au dimère à un temps de rétention relatif au monomère de 0,85 environ. Identifiez les pics dans le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner par comparaison au chromatogramme obtenu avec la solution témoin ; les pics ayant un temps de rétention plus petit que celui du dimère correspondent aux polymères et aux agrégats. La préparation à examiner satisfait à l'essai si dans le chromatogramme obtenu avec la solution à examiner:
- le temps de rétention par rapport au pic correspondant dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin est de 1 0,02 pour le monomère et pour le dimère;
- la somme du monomère et du dimère représente 90 p. 100 au minimum de la surface totale du chromatogramme et les polymères et agrégats représentent 3 p. 100 au maximum de la surface totale. Cette exigence ne s'applique pas aux préparations auxquelles de l'albumine a été ajoutée en tant que stabilisant ; dans le cas des préparations stabilisées par l'albumine, un essai de distribution de taille moléculaire est effectué pendant la fabrication avant l'addition du stabilisant.
Activité anticomplémentaire (V.2.1.13). La proportion du complément consommée n'est pas supérieure à 50 p. 100 (1 CH50 par milligramme d'immunoglobuline).
Activateur de prékallikréine (V.2.1.11). Au maximum 35 U.I. par millilitre, calculé par rapport à une dilution de la préparation à examiner contenant 3 p. 100 m/V d'immunoglobuline.
Hémagglutinines anti-A et anti-B (VIII.5). Effectuez les essais des hémagglutinines anti-A et anti-B. Si la préparation à examiner a une teneur en immunoglobulines supérieure à 3,0 p. 100 m/V, diluez-la jusqu'à cette dernière concentration avant de préparer les dilutions à utiliser dans l'essai. Les dilutions au 1/64 ne présentent pas de signes d'agglutination.
Teneur en eau (V.3.5.6). Déterminée par semi-microdosage sur 0,500 g au moins de la préparation à examiner, la teneur en eau d'une préparation cryodesséchée n'est pas supérieure à 3,0 p. 100.
Stérilité (V.2.1.1). La préparation à examiner satisfait à l'essai de stérilité.
Pyrogènes (V.2.1.4). La préparation à examiner satisfait à l'essai des pyrogènes. Injectez à chaque lapin, par kilogramme de masse corporelle, un volume correspondant à 0,5 g d'immunoglobuline, jusqu'à un maximum de 10 ml par kilogramme.
Anticorps contre l'antigène de surface de l'hépatite B. Le taux d'anticorps contre l'antigène de surface de l'hépatite B de la préparation à examiner,
déterminé par une méthode immunochimique appropriée (V.2.1.10) n'est pas inférieur à 0,5 U.I. par gramme d'immunoglobuline.

Conservation

Conservez la préparation liquide en récipient de verre incolore à l'abri de la lumière et à la température indiquée sur l'étiquette. Conservez la préparation cryodesséchée en récipient de verre incolore, sous vide ou sous un gaz inerte, à l'abri de la lumière et à une température ne dépassant pas 25 oC.

Etiquetage

L'étiquette du récipient et celle de l'emballage indiquent:
- dans le cas d'un produit liquide, le volume de préparation dans le récipient et la teneur en protéines exprimé en grammes par litre;
- dans le cas d'un produit cryodesséché, la quantité de protéines dans le récipient;
- la quantité d'immunoglobuline dans le récipient;
- la voie d'administration;
- les conditions de conservation;
- la date de péremption.
L'étiquette de l'emballage ou la notice jointe indique:
- dans le cas du produit cryodesséché, le nom ou la composition et le volume du liquide à ajouter;
- la distribution des sous-classes d'immunoglobuline G dans la préparation; - dans les cas appropriés, la quantité d'albumine ajoutée comme stabilisant; - la teneur maximale en immunoglobuline A.

VII.1.1. REACTIFS

Phosphate disodique dihydraté. Voir la monographie Dinatrii phosphas dihydricus.
Phosphate monosodique monohydraté. - NaH2PO4, H2O (Mr 138,0).
Silice (gel de) hydrophile pour chromatographie. Gel de silice de granulométrie très fine (3-10 ,m) et dont la surface a été traitée afin de la rendre hydrophile. La taille des particules peut être indiquée après le nom du réactif dans les essais où il est utilisé.
Poudre blanche, fine, homogène, pratiquement insoluble dans l'eau, dans l'alcool et dans le chloroforme.

V.2.1.11. ACTIVATEUR DE PREKALLIKREINE

L'activateur de la prékallikréine (PKA) transforme la prékallikréine en kallikréine et il peut être titré par sa capacité de scinder un chromophore d'un substrat peptidique synthétique, la vitesse de la réaction étant déterminée par spectrophotométrie et la concentration en PKA étant calculée par comparaison à une préparation de référence étalonnée en unités internationales.
L'unité internationale correspond à l'activité d'une quantité donnée de l'Etalon international qui est constitué par de l'activateur de prékallikréine cryodesséchée (1) .
Préparation du substrat de prékallikréine.
Pour éviter une activation par la coagulation, le sang ou le plasma employés pour la préparation de la prékallikréine ne doivent être mis en contact qu'avec de la matière plastique ou du verre siliconé.
Prélevez 9 volumes de sang humain sur 1 volume de solution anticoagulante (ACD, CPD ou une solution à 3,8 p. 100 m/V de citrate sodique R) additionnée de 1 mg par millilitre de bromure d'hexadiméthrine R. Centrifugez à 3 600 g pendant 5 minutes. Séparez le plasma et centrifugez à 6 000 g pendant 20 minutes pour séparer les plaquettes. Séparez le plasma pauvre en plaquettes et procédez à la dialyse contre 10 volumes de solution tampon A pendant 20 heures. Après dialyse, déposez le plasma sur une colonne chromatographique contenant 2 fois son volume d'agarose-DEAE pour chromatographie à échange d'ions R qui a été équilibré dans la solution tampon A. Procédez à l'élution au moyen de la solution tampon A à un débit de 20 ml/cm2/h. Recueillez l'éluat par fractions et enregistrez l'absorbance à 280 nm (V.6.19).
Réunissez les fractions qui contiennent le premier pic de protéines pour obtenir un volume 1,2 fois environ celui du plasma pauvre en plaquettes.
Afin de vérifier que le substrat est exempt d'activité kallikréine, mélangez 1 volume avec 20 volumes de la solution de substrat chromogène qui sera utilisé dans le titrage, préalablement chauffée à 37 oC et maintenez le mélange à 37 oC pendant 2 minutes. Le substrat est approprié si l'absorbance n'augmente pas de plus de 0,001 par minute. Ajoutez à la solution de substrat 7 g par litre de chlorure de sodium R et filtrez sur une membrane (porosité 0,45 ,m). Congelez le filtrat en parties aliquotes et conservez à - 25 oC; le filtrat peut également être cryodesséché avant la conservation.
Effectuez les opérations depuis la chromatographie jusqu'à la congélation en parties aliquotes pendant une seule journée de travail.

Titrage

Le titrage est effectué, de préférence au moyen d'un analyseur enzymatique automatique, à 37 oC, les volumes, concentrations des substrats et les temps d'incubation étant ajustés pour que la vitesse de réaction soit linéaire au moins juqu'à 35 U.I. par millilitre. Les étalons, les échantillons et le substrat de prékallikréine peuvent être dilués si nécessaire avec la solution tampon B.
Faites incuber les étalons ou les échantillons dilués avec le substrat de prékallikréine pendant 10 minutes: le volume de l'étalon ou de l'échantillon avant dilution ne doit pas excéder 1/10 du volume total du mélange d'incubation, afin d'éviter les erreurs dues aux différences de force ionique et de pH.
Faites incuber le mélange ou une partie du mélange avec un volume égal ou supérieur d'une solution d'un substrat chromogène synthétique reconnu spécifique à la kallikréine (par exemple, l'acétate de N-benzoyl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginine 4-nitroanilide R ou le dichlorhydrate de D-prolyl-L-phénylalanyl-l-arginine 4-nitroanilide) et dissous dans la solution tampon B. Enregistrez la variation de l'absorbance par minute (DA/min) pendant 2 minutes à 10 minutes à la longueur d'onde appropriée au substrat employé. Pour chaque mélange d'étalon ou d'échantillon, préparez un blanc en substituant la solution tampon B au substrat de prékallikréine.
DA/min par soustraction de la valeur obtenue pour le blanc correspondant.
Préparez une courbe d'étalonnage à partir des valeurs DA/min obtenues avec l'étalon et les concentrations respectives et déterminez la teneur en PKA de la préparation à examiner.
Solution tampon A Tris(hydroxyméthyl)aminométhane: R 6,055 g;
Chlorure de sodium R: 1,17 g;
Hexadiméthrine (bromure d') R: 50 mg;
Sodium (azide de): 0,100 g;
Dissolvez les réactifs dans de l'eau, ajustez le pH à 8,0 avec de l'acide chlorhydrique 2N et complétez à 1 000 ml avec de l'eau.
Solution tampon B Tris(hydroxyméthyl)aminométhane: R 6,055 g;
Chlorure de sodium R: 8,77 g;
Dissolvez les réactifs dans de l'eau, ajustez le pH à 8,0 avec de l'acide chlorhydrique 2N et complétez à 1 000 ml avec de l'eau.

VII.1.1. REACTIFS

Agarose-DEAE pour chromatographie à échange d'ions. Agarose réticulé portant des groupements diéthylaminoéthyle et présenté sous forme de billes.
N-Benzoyl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-arginine 4-nitroanilide (acétate de).
C35H42N8O8 (Mr 703).
Hexadiméthrine (bromure d'). (C13H30Br2N2)n. Polyméthobromure de 1,5-diméthyl-1,5-diaza-undécaméthylène. Poly(dibromure de 1,1,5,5-tétraméthyl-1,5-azonia-undecaméthylène).
Poudre blanche, amorphe, hygroscopique.
D-Prolyl-L-phénylalanyl-L-arginine 4-nitroanilide (dichlorhydrate de).
C26H36Cl2N8O5 (Mr 612).

V.2.1.13. Essai d'activité anticomplémentaire

de l'immunoglobuline

La détermination de l'activité anticomplémentaire (AAC) de l'immunoglobuline est effectuée par incubation d'une quantité donnée du produit à examiner (10 mg d'immunoglobuline) avec une quantité donnée de complément de cobaye (20 CH50) suivie du titrage du complément restant : l'activité anticomplémentaire est exprimée par la proportion du complément consommée en prenant le témoin complément comme 100 p. 100.
L'unité hémolytique d'activité complémentaire (CH50) est la quantité de complément qui, dans les conditions de réaction données, provoquera la lyse de 2,5 x 108 sur un nombre total de 5 x 108 érythrocytes sensibilisés de façon optimale.
Solution mère de magnésium et de calcium. Dissolvez 1,103 g de chlorure de calcium R et 5,083 g de chlorure de magnésium R dans de l'eau et complétez à 25 ml avec le même solvant.
Solution mère de tampon barbital. Dissolvez 207,5 g de chlorure de sodium R et 25,48 g de barbital sodique R dans 4 000 ml d'eau et ajustez à pH 7,3 avec de l'acide chlorhydrique 1N. Ajoutez 12,5 ml de solution mère de magnésium et de calcium et complétez à 5 000 ml avec de l'eau. Filtrez sur membrane (0,22 ,m) et conservez à 4 oC en récipient de verre.
Solution de gélatine. Dissolvez 12,5 g de gélatine R dans 800 ml environ d'eau et chauffez à ébullition au bain-marie. Refroidissez à 20 oC et complétez à 10 litres avec de l'eau. Filtrez sur membrane (0,22 ,m) et conservez à 4 oC. Utilisez uniquement une solution limpide.
Solution citratée. Dissolvez 8,0 g de citrate sodique R, 4,2 g de chlorure de sodium R et 20,5 g de glucose R dans 750 ml d'eau. Ajustez à pH 6,1 avec une solution à 10 p. 100 m/V d'acide citrique R et complétez à 1 000 ml.
Solution tampon gélatine-barbital. Ajoutez 4 volumes de solution de gélatine à 1 volume de solution mère de tampon barbital et mélangez. Ajustez à pH 7,3, si nécessaire, avec de l'acide chlorhydrique 1N ou de l'hydroxyde de sodium 1N et maintenez à 4 oC. Préparez une nouvelle solution chaque jour.
Sang de mouton stabilisé. Recueillez 1 volume de sang de mouton sur 1 volume de solution citratée et mélangez. Conservez le sang stabilisé à 4 oC pendant au moins 7 jours et au maximum 28 jours. (Le sang de mouton ou les érythrocytes de mouton stabilisés peuvent être obtenus auprès de plusieurs fournisseurs commerciaux.) Hémolysine. Antisérum contre les érythrocytes de mouton, préparé sur lapin. (De tels antisérums peuvent être obtenus auprès de plusieurs fournisseurs commerciaux.) Complément de cobaye. Mélangez les sérums préparés à partir du sang de 10 cobayes au moins. Séparez le sérum du sang coagulé par centrifugation à 4 oC environ. Conservez le sérum en petites quantités à une température inférieure à - 70 oC. Le sérum peut également être cryodesséché. Le complément de cobaye approprié a une activité de 200 CH50 par millilitre au moins. (Le complément de cobaye cryodesséché peut être obtenu auprès de plusieurs fournisseurs commerciaux.).

Mode opératoire

Standardisation de la solution d'érythrocytes de mouton à 5 p. 100. Séparez les érythrocytes de mouton par centrifugation d'un volume approprié du sang de mouton stabilisé ; lavez les cellules 3 fois au moins avec la solution tampon gélatine-barbital et préparez une suspension à 5 p. 100 V/V dans la solution tampon gélatine-barbital. Déterminez la concentration cellulaire par la méthode suivante. Ajoutez 0,2 ml de la suspension à 2,8 ml d'eau et centrifugez le lysat pendant 5 minutes à 1 000 g. La concentration cellulaire est appropriée si l'absorbance (V.6.19) du liquide surnageant déterminée à 541 nm est de 0,62 0,01. Corrigez la concentration cellulaire par addition de solution tampon gélatine-barbital selon la formule :

Vf Vi x A

Vi x A

Vf =

0,62

Vf = volume final,
Vi = volume initial,
A = absorbance déterminée à 541 nm pour la suspension d'origine.
Après ajustement, la suspension contient environ 1 x 109 cellules par millilitre.
Titrage de l'hémolysine Préparez des dilutions d'hémolysine selon le schéma du tableau 1.

TABLEAU 1

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Vous pouvez consulter le tableau dans le JO no 0146 du 25/06/94 Page 9191 a 9199
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Ajoutez 1,0 ml de la suspension à 5 p. 100 d'érythrocytes de mouton à chaque tube de la série de dilutions d'hémolysine à partir de la dilution 1: 75 et mélangez. Faites incuber à 37 oC pendant 30 minutes.
Transférez 0,2 ml de chaque mélange de dilution d'hémolysine à de nouveaux tubes et ajoutez 1,10 ml de solution tampon gélatine-barbital et 0,2 ml d'une dilution de complément de cobaye (par exemple 1: 150). Effectuez ces opérations en double.
Préparez 3 tubes témoins de cellules sans hémolyse avec 1,4 ml de solution tampon gélatine-barbital et 0,1 ml de la suspension d'érythrocytes de mouton à 5 p. 100.
Préparez 3 tubes témoins de cellules à hémolyse totale avec 1,4 ml d'eau et 0,1 ml de la suspension d'érythrocytes de mouton à 5 p. 100.
Faites incuber tous les tubes à 37 oC pendant 60 minutes et centrifugez à 1 000 g pendant 5 minutes.
Mesurez l'absorbance (V.6.19) de chaque liquide surnageant à 541 nm et calculez le degré d'hémolyse de chaque tube à l'aide de l'expression:

Aa - A1 x 100

Aa - A1

x 100

Ab - A1

Aa = absorbance des tubes contenant les dilutions d'hémolysine.
Ab = la moyenne de l'absorbance des trois tubes avec hémolyse totale.
Al = la moyenne de l'absorbance des trois tubes sans hémolyse.
Construisez une courbe sur papier graphique linéaire en portant le degré d'hémolyse (p. 100) en ordonnée et l'inverse de la dilution d'hémolysine en abscisse. La dilution optimale de l'hémolysine est déterminée à partir du graphique, en choisissant une dilution telle qu'une augmentation de la quantité d'hémolysine ne produit pas de variation sensible du degré d'hémolyse. Cette dilution est considérée comme contenant 1 unité d'hémolyse minimale (1 UHM) dans 1,0 ml. Pour la préparation des érythrocytes de mouton sensibilisés, la dilution d'hémolysine à hémolyse optimale contient 2 UHM par millilitre.
Le titrage de l'hémolysine n'est valable que si l'hémolyse maximale se situe entre 50 p. 100 et 70 p. 100. Sinon, répétez le titrage en utilisant une solution de complément plus ou moins diluée.
Préparation des érythrocytes de mouton sensibilisés de façon optimale (système hémolytique).
Préparez une quantité appropriée d'hémolysine diluée contenant 2 UHM/ml.
Préparez un volume égal de suspension standardisée d'érythrocytes de mouton à 5 p. 100. Ajoutez la dilution d'hémolysine à la suspension standardisée de cellules et mélangez. Faites incuber à 37 oC pendant 15 minutes; conservez au réfrigérateur à 2-8 oC et utilisez dans les 6 heures.
Titrage du complément.
Préparez une dilution appropriée de complément (par exemple 1: 250) avec la solution tampon gélatine-barbital et effectuez le titrage en double selon le tableau 2.
Ajoutez 0,2 ml d'érythrocytes de mouton sensibilisés à chaque tube, mélangez et faites incuber à 37 oC pendant 60 minutes. Refroidissez les tubes dans un bain de glace et centrifugez à 1 000 g pendant 5 minutes. Mesurez l'absorbance du surnageant à 541 nm et calculez le degré d'hémolyse (Y) à l'aide de l'expression:

Ac - A1

Ab - A1

Ac = absorbances des tubes 1 à 12.
Ab = moyenne de l'absorbance des tubes à 100 p. 100 d'hémolyse.
Al = moyenne de l'absorbance des tubes à 0 p. 100 d'hémolyse.

TABLEAU 2

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Vous pouvez consulter le tableau dans le JO no 0146 du 25/06/94 Page 9191 a 9199
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Tracez une courbe sur papier log-log en portant les valeurs de Y (1-Y) en abscisse en fonction du volume de complément dilué en millilitres en ordonnée. Construisez la meilleure droite à travers les points et notez l'ordonnée de la dose hémolytique à 50 p. 100 du complément au point où Y/(1-Y) = 1,0.
Calculez le nombre d'unités hémolytiques (CH50/ml) à l'aide de l'expression:

Ca x 5

Cd

Ca x 5

Cd = valeur inverse de la dilution de complément.
Ca = volume en millilitres de complément dilué qui produit 50 p. 100 d'hémolyse.
5 = facteur d'échelle.
L'essai n'est valable que si, entre 15 p. 100 et 85 p. 100 d'hémolyse, la courbe est une droite dont la pente se situe de 0,18 à 0,30.
Essai d'activité anticomplémentaire.
Diluez le complément de cobaye titré avec la solution tampon gélatine-barbital pour obtenir 100 CH50/ml. Ajustez l'immunoglobuline à examiner à pH 7, si nécessaire. Préparez les mélanges d'incubation suivants pour une immunolobuline contenant 50 mg/ml:

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Vous pouvez consulter le tableau dans le JO no 0146 du 25/06/94 Page 9191 a 9199
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Effectuez l'essai en parallèle sur l'immunoglobuline à examiner et sur l'immunoglobuline humaine PBR, selon les indications données dans le feuillet qui accompagne la préparation de référence pour le témoin AAC négatif et le témoin AAC positif. Si la préparation à examiner ne contient pas 50 mg/ml d'immunoglobuline, ajustez les volumes de la préparation et de solution tampon gélatine-barbital: par exemple, utilisez 0,33 ml d'une préparation qui contient 30 mg/ml d'immunoglobuline et ajoutez 0,47 ml de solution tampon gélatine-barbital pour arriver au même volume total de 0,8 ml. Fermez les tubes et faites incuber à 37 oC pendant 60 minutes. Ajoutez 0,2 ml de chaque mélange d'incubation à 9,8 ml de solution tampon gélatine-barbital pour diluer le complément. Effectuez des titrages du complément sur le contenu de chaque tube comme décrit pour déterminer l'activité complémentaire résiduelle (voir tableau 2).
Calculez l'activité anticomplémentaire de la préparation à examiner, par référence au témoin complément considéré comme étant 100 p. 100, à partir de l'expression:

a - b x 100

x 100

a

a = activité complémentaire moyenne (CH50/ml) des témoins.
b = activité complémentaire (CH50/ml) de la préparation à examiner.
L'essai n'est valable que si:
- les activités anticomplémentaires trouvées pour le témoin AAC négatif et le témoin AAC positif se situent dans les limites indiquées dans le feuillet qui accompagne la préparation de référence;
- l'activité complémentaire du témoin complément (a) est de 80 à 120 CH50/ml.

V.2.2.10. Essai de la fonction Fc

de l'immunoglobuline

Sang humain stabilisé. Recueillez du sang humain de groupe O sur une solution anticoagulante ACD. Conservez le sang stabilisé à 4 oC pendant 3 semaines au maximum.
Solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Dissolvez 1,022 g de phosphate disodique anhydre, 0,336 g de phosphate monosodique anhydre et 8,766 g de chlorure de sodium R dans 800 ml d'eau et complétez à 1 000 ml avec le même solvant.
Solution mère de magnésium et de calcium. Dissolvez 1,103 g de chlorure de calcium R et 5,083 g de chlorure de magnésium R dans de l'eau et complétez à 25 ml avec le même solvant.
Solution mère de tampon barbital. Dissolvez 207,5 g de chlorure de sodium R et 25,48 g de barbital sodique R dans 4 000 ml d'eau et ajustez à pH 7,3 avec de l'acide chlorhydrique 1 N. Ajoutez 12,5 ml de solution mère de magnésium et de calcium et complétez à 5 000 ml avec de l'eau. Filtrez sur membrane (0,22 ,m) et conservez à 4 oC en récipient de verre.
Solution tampon albumine-barbital. Dissolvez 0,150 g d'albumine bovine R dans 20 ml de solution mère de tampon barbital et complétez à 100 ml avec de l'eau.
Solution d'acide tannique. Dissolvez 10 mg d'acide tannique R dans 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Préparez immédiatement avant l'emploi.
Complément de cobaye. Mélangez les sérums préparés à partir du sang de dix cobayes au moins. Séparez le sérum du sang coagulé par centrifugation à 4 oC environ. Conservez le sérum en petites quantités à une température inférieure à - 70 oC. Le sérum peut également être cryodesséché. Immédiatement avant de commencer l'hémolyse à l'aide du complément, diluez à 125-200 CH50 par millilitre avec la solution tampon albumine-barbital et maintenez la solution diluée dans un bain de glace pendant l'essai.
Antigène rubéoleux. Antigène approprié pour les titrages de l'inhibition d'hémagglutination. Titre > 256 unités HA.
Traitement des érythrocytes à l'acide tannique. Séparez les érythrocytes par centrifugation d'un volume approprié de sang humain stabilisé. Lavez les érythrocytes 3 fois au moins avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2 puis mettez-les en suspension à 2 p. 100 V/V dans la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Prélevez 0,1 ml de solution d'acide tannique et complétez à 7,5 ml avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2 (concentration finale 1,3 x 10-4 p. 100 m/V); mélangez un volume de la dilution récemment préparée et un volume de la suspension d'érythrocytes et faites incuber à 37o C pendant dix minutes. Recueillez les cellules traitées à l'acide tannique par centrifugation (400-800 g pendant dix minutes),
rejetez le liquide surnageant et lavez les érythrocytes une fois avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Remettez les érythrocytes en suspension à 1 p. 100 V/V dans la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2.
Addition de l'antigène aux érythrocytes. Prélevez un volume approprié (Vs) d'érythrocytes traités à l'acide tannique, ajoutez 0,2 ml d'antigène rubéoleux par 1,0 ml d'érythrocytes et faites incuber à 37o C pendant trente minutes. Recueillez les cellules par centrifugation (400-800 g pendant dix minutes) et rejetez le surnageant, en laissant un volume de 200 ,l. Ajoutez un volume de solution tampon albumine-barbital égal au liquide surnageant rejeté, remettez les érythrocytes en suspension, recueillez-les comme il est décrit ci-dessus et répétez le lavage. Complétez les 200 ,l obtenus aux trois quarts de Vs; on obtient ainsi le volume initial (Vi). Mélangez 900 ,l de solution tampon albumine-barbital et 100 ,l de Vi, qui est ainsi réduit au volume résiduel Vr, et déterminez l'absorbance initiale à 541 nm (A). Diluez Vr par un facteur égal à A à l'aide de solution tampon albumine-barbital. On obtient ainsi le volume final ajusté Vf = Vr x A d'érythrocytes humains sensibilisés et une valeur pour A de 1,0 0,1 dans le cas d'une dilution au 1/10.
Liaison de l'anticorps sur les érythrocytes traités à l'acide tannique et couverts d'antigène. Préparez les solutions suivantes successivement et en double. Utilisez une cuve semi-micro (par exemple, des cuves à usage unique) ou un tube à essai pour chaque solution.
1. Solutions à examiner. Prélevez des volumes de la préparation à examiner contenant 30 mg et 40 mg d'immunoglobuline respectivement et complétez à 900 ,l avec la solution tampon albumine-barbital.
2. Solutions de référence. Préparez la solution comme il est décrit pour la solution à examiner à partir de l'immunoglobuline humaine PBR.
3. Témoin complément. 900 ,l de solution tampon albumine-barbital. A chaque cuve/tube à essai, ajoutez 100 ,l d'érythrocytes humains sensibilisés et mélangez soigneusement.
Laissez reposer pendant quinze minutes, ajoutez 1 000 ,l de solution tampon albumine-barbital, recueillez les érythrocytes par centrifugation (1 000 g pendant dix minutes) de la cuve/tube à essai et enlevez 1 900 ,l du liquide surnageant. Ajoutez 1 900 ,l de solution tampon albumine-barbital et répétez le lavage en laissant un volume final de 200 ,l. Les échantillons peuvent être conservés à 4 oC pendant 24 heures.
Hémolyse provoquée par le complément. Pour la détermination de l'hémolyse,
ajoutez 600 ,l de solution tampon albumine-barbital chauffée à 37 oC à l'échantillon à examiner, remettez les érythrocytes en suspension avec précaution en les pipettant plusieurs fois (cinq fois au moins) et placez la cuve dans le porte-échantillon d'un spectrophotomètre muni d'un thermostat.
Après deux minutes, ajoutez 200 ,l de complément de cobaye dilué à 125-200 CH50/ml, mélangez soigneusement en pipettant le mélange 2 fois puis commencez immédiatement l'enregistrement de l'absorbance à 541 nm en fonction du temps, en utilisant la solution tampon albumine-barbital comme liquide de compensation. Arrêtez l'enregistrement si la courbe de l'absorbance en fonction du temps a nettement dépassé le point d'inflexion.
Evaluation. Déterminez la pente (S) de la courbe d'hémolyse au point d'inflexion approximatif: délimitez sur la courbe dans la partie à plus forte pente des sections par intervalle de temps approprié (par exemple, t = 1 min.) et calculez S, exprimé en A par minute, entre les points d'intersections adjacents. Trouvez la valeur maximale de la pente (Sexp).
Déterminez l'absorbance de départ (As) par extrapolation de la courbe, qui est presque linéaire et parallèle à l'axe du temps dans les premières minutes de l'enregistrement.
Corrigez Sexp selon l'expression:

S' Sexp

Sexp

S' =

AS

Calculez la moyenne arithmétique des valeurs de S' pour chaque préparation. Calculez l'indice de la fonction Fc (IFc) à partir de l'expression:

I Fc 100 x (S' - S'c)

100 x (S' - S'c)

I Fc =

S's - S'c

S' = moyenne arithmétique de la pente corrigée pour la préparation à examiner.
S's = moyenne arithmétique de la pente corrigée pour la préparation de référence.
S'c = moyenne arithmétique de la pente corrigée pour le témoin complément. Calculez l'indice de la fonction Fc de la préparation à examiner. La valeur n'est pas inférieure à celle indiquée dans le feuillet qui accompagne la préparation de référence.

VII.1.1. REACTIFS

Phosphate disodique anhydre. Na2HPO4 (Mr 142,0).
Phosphate monosodique anhydre. NaH2PO4 (Mr 120,0).

V.6.25. Osmolalité

En pratique, l'osmolalité est une façon globale de mesurer la contribution des différents solutés, présents dans une solution, à la pression osmotique de cette solution.
Une valeur approximative acceptable de l'osmolalité xm d'une solution aqueuse est donnée par:

xm umf

Si le soluté n'est pas ionisé, u = 1; dans le cas contraire, u est le nombre total d'ions préexistants ou éventuellement formés par solvolyse à partir d'une molécule du soluté.
m est la molalité de la solution, c'est-à-dire le nombre de moles de soluté par kilogramme de solvant,
f est le coefficient osmotique molal permettant de tenir compte des interactions entre ions de charge opposée au sein de la solution. Il dépend de la valeur de m. Lorsque la complexité des solutions augmente, f devient difficilement mesurable.
L'unité d'osmolalité est l'osmole par kilogramme (osmol/kg) mais c'est très généralement son sous-multiple, la milliosmole par kilogramme (mosmol/kg),
qui est utilisé.
Sauf indication contraire, l'osmolalité est déterminée par mesure de l'abaissement du point de congélation. Dans ce cas, la relation existant entre l'osmolalité et l'abaissement T est:

xm 1,86 x 1 000 mosmol/kg

T

xm =

x 1 000 mosmol/kg

1,86

Appareillage. - L'appareil utilisé (osmomètre) comprend:
- un système de refroidissement du récipient de mesure;
- un système de mesure de la température constitué d'une résistance variable avec la température (thermistance) et muni d'un dispositif approprié de mesure du courant ou de la différence de potentiel qui peut être étalonné en abaissement de température ou directement en osmolalité;
- l'appareil est généralement muni d'un dispositif permettant l'agitation du prélèvement.

Mode opératoire

Préparez les solutions de référence requises, selon les indications du tableau. Déterminez le zéro de l'appareil avec de l'eau distillée. Etalonnez l'appareil à l'aide des solutions de référence, en introduisant 50 ,l à 250 ,l d'échantillon dans la cellule de mesure et en déclenchant le système de réfrigération. Généralement la mise en marche de l'agitateur est programmée à une température inférieure à l'abaissement cryoscopique prévu afin d'arrêter la surfusion. Un système approprié indique la réalisation de l'équilibre.
Avant chaque mesure, rincez la cellule de mesure avec la solution à examiner. Réalisez les mêmes opérations avec la préparation à examiner. Lisez directement l'osmolalité ou calculez-la à partir de l'abaissement cryoscopique mesuré. La valeur doit être comprise entre deux valeurs de la gamme d'étalonnage.

Art. 2. - Le présent arrêté entre en application le 1er juillet 1994.

Art. 3. - Le directeur général de l'Agence du médicament est chargé de l'exécution du présent arrêté, qui sera publié au Journal officiel de la République française.