Les réactifs définis dans le présent arrêté ont pour but de réaliser les examens immuno-hématologiques érythrocytaires chez les donneurs de sang ainsi que chez les receveurs, en vue de prévenir les accidents transfusionnels et les accidents d'allo-immunisation foeto-maternelle.

Les réactifs mentionnés à l'article précédent sont les suivants :

- les hématies humaines : les hématies-tests pour les groupages sanguins, la détection ou l'identification d'allo-anticorps antiérythrocyte, les hématies non spécifiques utilisées comme support pour des tests de lyse ou d'agglutination ;

- les réactifs d'origine humaine : les réactifs issus du sérum ou du plasma humain contenant des anticorps spécifiques, les réactifs d'origine humaine produits in vitro ;

- les réactifs d'origine animale utilisés en immuno-hématologie érythrocytaire ;

- les réactifs issus de sérum ou de plasma animaux ;

- les réactifs d'origine animale produits in vitro ; - les lectines utilisées en immuno-hématologie érythrocytaire.

Sont également inclus :

- les cartes de contrôle prétransfusionnel ;

- les réactifs d'immuno-hématologie utilisés sur les équipements automatisés.

Le dossier réglementaire pour tous les réactifs précités, prévu à l'article 5 du décret du 8 septembre 1982 susvisé, est adressé en triple exemplaire au laboratoire national de la santé qui transmet l'un d'eux au centre national de référence pour les groupages sanguins dénommés ci-après CNRGS.

Le contrôle des réactifs concernés par le présent arrêté est effectué par le CNRGS.

Les hématies-tests d'origine humaine sont des hématies de groupes sanguins connus, destinées à la détermination des groupes sanguins et à la détection ou à l'identification d'anticorps antiérythrocytaires.

Les hématies-tests définies par l'article 5 du présent arrêté sont obtenues à partir du sang prélevé chez des donneurs possédant les caractéristiques appropriées, les prélèvements étant effectués dans les conditions fixées par l'arrêté susvisé du 17 mai 1976.

Ces hématies-tests peuvent être présentées en tant que sang total ou sous forme d'une suspension globulaire ; dans ce cas, l'établissement producteur doit indiquer la concentration de la suspension et la nature du liquide de suspension. Le contenu doit être stérile.

Le milieu de suspension naturel ou artificiel ne doit contenir aucun anticorps antiérythrocytaire détectable à l'exclusion des anticorps anti-A et anti-B.

Chaque détermination de phénotype est réalisée à deux reprises à l'aide de deux séries de réactifs différents.

La préparation d'hématies-tests peut contenir un antiseptique ou un antibiotique ; elle est dépourvue d'antigène HBs recherché par méthode radio-immunologique ou de sensibilité équivalente. Tout autre agent infectieux connu et décelable responsable de maladie transmissible grave doit être recherché.

Les hématies-tests doivent pouvoir être conservées au moins pendant quatorze jours à la température de + 4 degrés C. La durée de péremption ne peut excéder 35 jours après le prélèvement.

L'établissement producteur conserve jusqu'à la date de péremption un échantillon du lot mis en circulation qui servira éventuellement aux contrôles prévus à l'article 10 du présent arrêté.

L'établissement producteur s'assure, pour chaque préparation que le test direct à l'antiglobuline, en utilisant une antiglobuline polyvalente conforme, est négatif.

Chaque lot d'hématies-tests est accompagné d'une notice portant au moins les indications spécifiques suivantes :

Nom et adresse de l'établissement de transfusion sanguine producteur ;

Mention de l'origine humaine ;

Indication des spécificités ;

Date de préparation et date limite de conservation ;

Eventuellement une notice d'utilisation, et être en tout conforme aux indications du décret du 8 septembre 1982 susvisé.

Les hématies-tests se présentent sous les formes suivantes :

1° Hématies-tests ABO et Rh standard destinées à l'épreuve sérique de la détermination du groupage sanguin ABO, ainsi qu'à la détermination du groupage Rh standard, à titre de témoins négatifs ou positifs.

L'échantillonnage comporte quatre échantillons de globules rouges A1, A2, B et O. Au moins un des échantillons doit être connu comme Rh négatif, un autre comme Rh positif ;

2° Hématies-tests de dépistage pour la détection des anticorps correspondant aux antigènes D, C, c, E, e, Kell, Cellano, M, N, S, s, P1, Le a, Le b, Fy a, Fy b, JK a et JK b.

L'échantillonnage comporte de deux à quatre échantillons d'hématies-tests sélectionnées de groupe O. Tout mélange d'hématies-tests est interdit ;

3° Gamme d'hématies-tests pour l'identification (et le dépistage) :

Elle doit comporter dix échantillons d'hématies-tests de phénotypes sélectionnés dans les systèmes Rhésus, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNSs et Lutheran, parmi lesquels au moins un échantillon des phénotypes suivants : D- C- c+ E- e+ Le (a+), D- C- c+ E- e+ K+, D+ C+ c-E-e+, D+ C- c+ e+ E-, Le (a-b-).

Cet échantillonnage doit permettre au moins une orientation dans l'identification d'un anticorps courant isolé ;

4° Gamme d'hématies-tests de référence :

Elle comporte dix échantillons dont le phénotype est établi dans les systèmes de groupes sanguins connus et pour le plus grand nombre possible d'antigènes dits "publics" et "privés".

Cet échantillonnage doit permettre l'identification des anticorps courants, ainsi que des anticorps plus rares correspondant aux antigènes non monomorphiques connus. Il doit permettre une orientation dans l'identification des mélanges d'anticorps ;

5° Hématies-tests d'intérêt particulier : notamment les hématies provenant du cordon ombilical.

Le CNRGS peut contrôler la conformité des gammes aux normes ci-dessus définies et aux caractéristiques annoncées par l'établissement producteur au moyen des échantillons prévus à l'article 7 du présent arrêté. Le CNRGS communique au laboratoire national de la santé les résultats des contrôles des produits qui ne respecteraient pas les spécifications de l'article 3 du décret du 1er juillet 1983 susvisé.

Les sérums-tests d'origine humaine pour les groupages sanguins sont des sérums capables de reconnaître spécifiquement l'antigène ou les antigènes qui leur correspondent. Ils sont désignés par le symbole, précédé du préfixe "anti", du ou des antigènes reconnus par le ou les anticorps qu'ils renferment.

Les sérums-tests définis par l'article 11 du présent arrêté sont obtenus à partir du sang prélevé chez des sujets dont le sérum ou plasma possède les anticorps appropriés, les prélèvements étant effectués dans les conditions fixées par l'arrêté susvisé du 17 mai 1976.

Ces sérums-tests peuvent être présentés à l'état liquide ou à l'état lyophilisé ; ils peuvent contenir des colorants, des antibiotiques, des antiseptiques ou des substances visant à en renforcer l'activité ou la stabilité. A l'état liquide, ils ne doivent contenir aucun gel, sédiment ou particule visibles ; ils doivent être dépourvus d'antigène HBs recherché par méthode radio-immunologique ou de sensibilité équivalente. Tout autre agent infectieux connu et décelable responsable de maladie transmissible grave doit être recherché.

L'établissement producteur conserve jusqu'à la date de péremption pour chaque lot de sérums-tests mis en circulation, un nombre suffisant d'échantillons qui serviront éventuellement aux contrôles prévus à l'article 16 du présent arrêté.

Chaque récipient de sérum-test est muni d'une étiquette portant les indications suivantes :

Nom et, si possible, adresse de l'établissement producteur ;

Mention de l'origine humaine ;

Volume ou, si le sérum-test est à l'état desséché, volume du solvant à rajouter pour reconstitution ;

Numéro de contrôle du CNRGS, qui tiendra lieu de numéro d'identification du lot de fabrication concerné ;

Indication de la spécificité ;

Date de péremption et mode de conservation.

Chaque récipient de sérum-test doit être accompagné d'une notice d'emploi : celle-ci reproduit les renseignements prescrits par l'article 14 du présent arrêté et comporte en outre les indications technologiques détaillées concernant l'utilisation : concentration et milieu de suspension des hématies, mention éventuelle de la nécessité d'addition de complément, mention des techniques par lesquelles le sérum-test doit être utilisé et également des techniques à ne pas utiliser.

Les normes exigibles des sérums-tests pour les groupages sanguins sont décrites dans l'annexe I du présent arrêté. Un certificat de contrôle de chaque lot est délivré par le CNRGS et doit être conservé par l'établissement producteur à la disposition des autorités.

Les réactifs d'origine humaine produits in vitro et utilisés en immunohématologie érythrocytaire sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux synthétisés par des hybridomes humains ou des cellules lymphoblastoïdes humaines.

Les réactifs d'origine humaine produits in vitro et utilisés en immunohématologie érythrocytaire pour les groupages sanguins doivent reconnaître spécifiquement l'antigène qui leur correspond. Ils sont désignés par le symbole, précédé du préfixe "anti", de l'antigène reconnu par le ou les anticorps qu'ils renferment. Sur la notice associée doit être mentionnée la dénomination de la lignée ou des lignées cellulaires productrices de ces anticorps.

La présentation et les caractéristiques de ces réactifs correspondent à celles définies par les articles 3, 13, 14 et 15 du présent arrêté.

Avant toute première distribution les anticorps monoclonaux d'origine humaine doivent répondre aux conditions de l'étude préliminaire décrite dans l'annexe III du présent arrêté.

Les normes exigibles pour ces réactifs de groupage sont décrites dans l'annexe I du présent arrêté. Un certificat de contrôle de chaque lot est délivré par le CNRGS et doit être conservé par l'établissement producteur à la disposition des autorités.

Les lectines utilisées en immunohématologie érythrocytaires sont essentiellement des produits d'origine végétale reconnaissant des antigènes spécifiques cryptiques ou non de la membrane normale ou pathologique des globules rouges humains. Elles sont désignées par le symbole de la spécificité reconnue précédée, d'une part, du préfixe "anti" et, d'autre part, par l'appellation du produit d'origine.

Comme pour les sérums-tests leurs caractéristiques et leurs normes sont celles décrites dans les articles 3, 13, 14, 15 et 16 du présent arrêté.

Les réactifs utilisés pour la réalisation des cartes de contrôle prétransfusionnel doivent être contrôlés par le CNRGS. Ils doivent être conformes aux normes décrites dans l'annexe I du présent arrêté. Un certificat de contrôle de chaque lot est délivré par le CNRGS et doit être conservé par l'établissement producteur à la disposition des autorités.

Le CNRGS peut contrôler la conformité des cartes de contrôle prétransfusionnel aux normes décrites dans l'annexe I du présent arrêté.

Avant toute première distribution, le CNRGS contrôle les réactifs dans les conditions d'utilisation et délivre un certificat de conformité aux spécifications précisées dans l'annexe I du présent arrêté.

L'arrêté du 9 mai 1977, fixant la spécification et les conditions de préparation, de conservation et de distribution des sérums tests pour les groupages sanguins et des globules rouges tests pour les groupages sanguins et la détection ou l'identification d'anticorps, est abrogé.

Instructions relatives aux réactifs de groupages sanguins humains

A. - Dispositions générales applicables à tout réactif
pour groupages sanguins.

1° Spécificité.

Le réactif doit, dans la technique d'utilisation recommandée par l'établissement producteur, reconnaître exclusivement les échantillons de globules rouges porteurs de l'antigène correspondant et ne doit réagir avec aucun antigène reconnu distinct de ce dernier.

Il ne doit manifester, dans cette technique d'utilisation, ni activité hémolysante, ni formation de pseudo-agglutinats, ni effet de prozone.

2° Puissance.

Elle est appréciée par trois critères : le titre, le score d'agglutination, l'intensité ; en outre, pour les réactifs utilisables sur plaque, l'avidité doit être appréciée :

a) Le titre est mesuré en faisant des dilutions du réactif par progression géométrique de raison 2 dans un milieu approprié en un volume total de 10 gouttes, avec essorage mais sans rinçage de la pipette lors du transfert d'un tube à l'autre. A chaque volume de diluant mis en réaction est ajouté un volume égal de suspension de globules rouges à concentration déterminée et dans un milieu défini. Le titre est l'inverse de la dernière dilution ou l'agglutination est encore visible, étant entendu que le mélange contenant le réactif pur, non préalablement dilué, représente la dilution 1 : 1 et non 1 : 2. Il est recommandé de contrôler le titre obtenu par un essai sur une dilution unique. Pour les réactifs disposant d'étalon international, le titre sera exprimé en unité internationale et pour les autres par la dernière dilution positive. Le centre national de référence pour les groupages sanguins est chargé de constituer les étalons nationaux, d'en déterminer le titre en unités internationales (UI) d'après les étalons internationaux et de les distribuer aux divers établissements producteurs de réactifs en France ;

b) Le score d'agglutination est évalué conjointement au titrage en totalisant les valeurs conventionnelles suivantes attribuées à l'aspect de chaque réaction de la série de titrage : +++ = score 10, ++ = score 8, + = score 5, (+) = score 2, - = score 0 ;

c) L'intensité est définie par l'aspect de l'agglutination obtenue avec le réactif non dilué vis-à-vis de globules rouges lavés ou non selon le mode d'utilisation ;

d) L'avidité est appréciée, pour les sérums-tests utilisables sur plaque, par la mesure au chronomètre du temps d'apparition des premiers agglutinats visibles à l'oeil nu, après mélange rapide d'une goutte de sérum-test non dilué et d'une goutte de suspension globulaire adéquate.

3° Péremption des réactifs.

Il est conseillé de considérer une durée de conservation de douze mois pour les réactifs liquides et de trente-six mois pour les réactifs lyophilisés, dans les conditions de température préconisées par l'établissement producteur.

B. - Dispositions particulières à chaque catégorie de réactifs.

I. - Réactifs de groupage ABO.

1° Anti-A, anti-B, anti-AB :

a) Coloration : si les sérums tests sont artificiellement colorés, leur couleur et celle de l'étiquette des récipients les contenant doivent être bleu pour l'anti-A, jaune pour l'anti-B et incolore pour l'anti-AB ;

b) Puissance : les normes minimales suivantes sont exigibles :

c) Technique de contrôle :

1. Globules rouges-tests :

Les globules rouges-tests A1, A2 ou B sont constitués d'un mélange de trois échantillons A1, A2 ou B.

Ils sont utilisés après lavages. Leur concentration est de 10 % en saline (environ 900 000/mm3) pour l'évaluation, en tube, du titre et du score de l'agglutination.

2. Mesure de l'avidité :

Elle s'effectue en déposant côte à côte sur plaque à 20 degrés C environ une goutte, 50 microns de l environ, de réactif et une goutte de suspension globulaire (10 %). Un mélange rapide est effectué en étalant à l'aide d'un agitateur, d'un mouvement spirale centrifuge pour former une surface de réaction circulaire de 3 cm de diamètre. Le chronomètre est alors déclenché et le temps d'apparition des premiers agglutinats visibles à l'oeil nu est mesuré. L'avidité est celle correspondant à la moyenne de deux mesures faites par deux personnes.

3. Mesure de l'intensité :

Elle est appréciée trois minutes après la fin de l'étalement en agitant la plaque pour homogénéiser le mélange. Au terme de ces trois minutes, l'agglutination doit être totale (+++), sans globule rouge libre, laissant apparaître le fond de la plaque.

4. Mesure du titre et du score de l'agglutination :

La dilution du sérum se fait en saline, la réaction proprement dite effectuée à 20 degrés C environ en tube à fond hémisphérique de 12 mm de diamètre intérieur, contenant deux gouttes du sérum ou de ses dilutions et deux gouttes d'une suspension saline à 1 % de globules rouges-tests. Ces tubes sont alors centrifugés à environ 500 g durant une minute. Après une légère agitation, pour décoller le culot, les réactions sont lues à l'oeil nu sur fond blanc et évaluées selon la convention suivante :

+++ = Score 10 : agglutinat non dissocié par le décollement du culot et fragmenté en trois amas au maximum.

++ = Score 8 : culot fragmenté en quatre à dix amas lors du décollement.

+ = Score 5 : réaction formée de plus de dix petits agglutinats dissociés par le décollement.

(+) = Score 2 : agglutination très fine mais encore visible.

- = Score 0 : absence d'agglutination.

La valeur du titre est exprimée en unité internationale (UI) par comparaison, dans les mêmes conditions techniques, avec le sérum de référence local préparé et conservé par le producteur du sérum-test lui-même et titré d'après le sérum étalon national qui est préparé par le centre national de référence des groupages sanguins et qui est à son tour titré d'après l'étalon international préparé par les laboratoires de l'OMS.

Exemple de mesure d'un titre :

L'étalon national anti-B contenant 256 UI d'anticorps fourni par le centre national de référence est testé parallèlement avec un sérum anti-B inconnu dans deux laboratoires différents. Bien que le titre effectif de ce sérum soit de 256 pour l'un et de 64 pour l'autre, le titre relatif affiché par comparaison avec celui de l'étalon sera 128 pour les deux laboratoires.

d) Exigences particulières :

Le réactif anti-A doit agglutiner de façon visible les globules rouges A3 de référence. Le sérum test anti-A + B doit agglutiner de façon visible les globules rouges Ax et si possible Bx de référence. Le sérum test anti-B doit agglutiner de façon visible les globules rouges B3 de référence. Le contrôle de réactivité de ces globules rouges se fait sur plaque, vis-à-vis d'une suspension saline de globules rouges à 5 %. La réaction doit être positive en moins de six minutes. Les échantillons de globules rouges A3, Ax et B3 et si possible Bx sont distribués par le centre national de référence pour les groupes sanguins aux centres de transfusion sanguine producteurs de sérums-tests ;

2° Les réactifs anti-A1 et anti-H :

Ils doivent être utilisables dans les mêmes techniques que les réactifs anti-A, anti-B et anti-A + B et leur contrôle s'effectue selon les mêmes procédés :

Le réactif anti-A1, testé sur plaque à 20 degrés C environ vis-à-vis d'un pool de trois échantillons de globules rouges A1, à 10 % en suspension saline ou en sérum AB, doit, après trois minutes d'étalement, avoir une intensité de ++. Son titre et son score d'agglutination, appréciés par la technique de centrifugation en tube vis-à-vis du même mélange de globules rouges mais à 1 % doivent être respectivement, au minimum, de 8 et 25 ;

Le réactif anti-H, testé sur plaque à 20 degrés C environ vis-à-vis d'un mélange de trois échantillons de globules rouges A2 et d'un mélange de trois échantillons de globules rouges 0 à 10 % en suspension saline ou en sérum AB doit, après trois minutes d'étalement, avoir une intensité minimum de ++. Après le même délai, l'intensité de l'agglutination d'un mélange de trois échantillons de globules rouges A1, à 10 % en suspension saline, doit être nulle ou nettement inférieure à celle de globules rouges A2, et les globules rouges de type Bombay classique doivent rester inagglutinables quel que soit le temps de contact entre le sérum et les globules rouges ;

Son titre et son score d'agglutination, appréciés par la technique de centrifugation en tube, vis-à-vis des globules rouges à 1 %, en suspension saline ou en sérum AB, doivent être respectivement au minimum de huit et trente contre les globules rouges 0, au maximum de deux et dix contre les globules rouges A1, et nuls conte les globules rouges Bombay.

II. - Réactifs de groupage Rhésus.

1° Anti-D (anti-Rh standard) pour groupage sur plaque :

a) Aucune coloration artificielle du réactif n'est recommandée. Les normes minimales exigibles sont les suivantes :

b) Technique de contrôle :

L'avidité et l'intensité sont appréciées sur plaque chauffée à 40 °C environ contre une suspension à 40 % en sérum AB humain d'un pool de trois échantillons de globules rouges D+ C+ c+ E- e+ préalablement lavés. Les détails de la manipulation sont identiques à ceux décrits pour les sérums-tests de groupage ABO ; cependant la surface circulaire d'étalement est ici de 2 centimètres de diamètre. L'intensité sera également déterminée vis-à-vis d'hématies non lavées ;

Le titre et le score sont évalués en microtube (6 mm de diamètre intérieur) par lecture microscopique, après une incubation de une heure trente à deux heures à 37 degrés C d'une goutte de sérum-test ou de ses dilutions en sérum AB humain et d'une goutte du même pool de globules rouges D+ C+ c+ E- e+ à concentration de 2 % en sérum AB humain ;

c) Exigences particulières :

Le réactif anti-D plaque doit agglutiner dans sa technique d'utilisation des échantillons D faible de référence distribués par le centre national de référence pour les groupages sanguins.

Le centre de transfusion sanguine producteur de sérums-tests anti-D doit également préparer un réactif "témoin négatif" dont la composition est la même que la dilution de l'anti-D, et qui, utilisé parallèlement au réactif anti-D contre les mêmes globules rouges, ne doit pas les agglutiner.

2° Autres réactifs anti-rhésus utilisables sur plaque :

a) Aucune coloration artificielle du réactif n'est recommandée.

Les normes minimales exigibles sont les suivantes :

b) Techniques de contrôle :

Elles sont identiques à celles décrites pour l'anti-D plaque. La concentration des globules rouges peut cependant s'écarter, si le centre producteur le souhaite, de celle préconisée pour l'anti-D. Dans ce cas les concentrations retenues doivent être clairement indiquées dans la notice d'utilisation ;

c) Exigences particulières :

L'anti-C doit agglutiner dans sa technique d'utilisation les globules rouges ayant l'antigène C et dépourvus de l'antigène Ce ainsi que les globules rouges Cw + communs ;

L'anti-E doit reconnaître dans sa technique d'utilisation les globules rouges ayant l'antigène E et dépourvus de l'antigène cE ;

d) Les réactifs plurispécifiques (anti-D + C + E, anti-D + C, etc.).

Les exigences qualitatives et quantitatives pour chaque spécificité du mélange d'anticorps sont analogues à celles des mêmes réactifs.

Il est nécessaire que les diverses spécificités contenues dans ces réactifs puissent se manifester dans la même technique. Toute amélioration visant à simplifier les techniques devra être prise en compte, en conservant néanmoins les mêmes normes de sécurité.

III. - Autres réactifs de groupage

a) Les caractéristiques suivantes sont mentionnées à titre indicatif :

b) Techniques de contrôle.

Les techniques recommandées dans ce tableau ne sont pas exclusives. Les réactifs de même spécificité peuvent être mis en circulation, même lorsque leur technique optimale d'utilisation est différente de celles-ci, à condition toutefois qu'ils répondent, dans ces techniques, aux normes minimales exigibles.

Les globules rouges-tests sont faits d'un mélange de deux ou trois échantillons préalablement lavés et mis en suspension dans le milieu adéquat. Ce milieu est la solution saline physiologique pour les tests en saline 22 degrés C, en fait à la température du laboratoire (22 degrés C plus ou moins 3 degrés C), saline 37 degrés C et test indirect à l'antiglobuline. Ils sont préalablement trypsinés pour les tests en trypsine saline 22 degrés C et test indirect trypsiné à l'antiglobuline. La concentration des globules rouges est de 2 % pour les tests en saline. Elle est de 3 à 5 % pour les tests à l'antiglobuline.

Détails des techniques recommandées :

1. Les tests "en saline" se font en microtube par incubation à 22 degrés C ou à 37 degrés C d'une goutte de sérum ou de ses dilutions en saline et d'une goutte de suspension saline des globules rouges pendant 90 minutes, la lecture étant microscopique.

2. Les tests en "AB 37 degrés C" sont exécutés de façon analogue, mais les globules rouges sont en milieu AB et les dilutions du sérum se font en sérum AB.

3. Les tests indirects à l'antiglobuline se font par incubation de quarante-cinq minutes à 37 degrés C de volumes égaux de sérum ou de ses dilutions en saline et de globules rouges en suspension saline à 3 %. Après trois lavages, la réaction à l'antiglobuline proprement dite se fait entre une goutte d'antiglobuline conforme et une goutte de suspension saline de globules rouges lavés. La concentration de celle-ci est de 5 % pour les tests sur plaque, la lecture se faisant au terme de trois minutes, et de 2 % pour les tests en tube utilisant une centrifugation à 130 x g. environ pendant trente secondes suivie d'une lecture microscopique.

Pour les anticorps, dont l'activité n'est décelable dans cette technique que grâce à leur capacité de fixation du complément, il est nécessaire, au terme du temps de sensibilisation, de retirer après centrifugation le surnageant sérique et de le remplacer par un volume égal de sérum AB frais, source de complément. Les lavages et le test à l'antiglobuline proprement dit n'interviendront qu'après vingt minutes d'incubation supplémentaire à 37 degrés C de ce nouveau mélange.

c) Exigences particulières :

1. Le réactif ne doit certes contenir aucun autre anticorps que celui indiqué sur l'étiquette, capable de réagir dans sa technique d'utilisation. Il est cependant indispensable de tester le réactif par toutes les techniques courantes et d'indiquer dans la notice d'utilisation la présence d'éventuels anticorps associés et les techniques par lesquelles ils seraient décelables. Un tel renseignement est indispensable pour éviter les erreurs d'interprétation lorsque l'utilisateur s'écarte des conditions techniques recommandées et surtout lorsqu'il utilise le réactif dans les expériences de fixation-élution tout en respectant ces conditions.

2. Pour chaque réactif, les globules rouges porteurs d'antigènes faibles doivent être testés et leur réaction notifiée à l'utilisateur. La liste de ces globules rouges n'est pas limitative et sera fonction de la richesse et des disponibilités du laboratoire national de contrôle. L'absence de réaction positive, vis-à-vis de certains de ces échantillons, ne peut à elle seule rendre le réactif non conforme, mais il est nécessaire que la notice d'utilisation mentionne la réactivité du produit vis-à-vis de ces antigènes particuliers.

3. Les réactifs anti-Rhésus (anti-C, c, E, e) doivent en outre répondre aux exigences mentionnées ci-dessus (II-2 °c).

Instructions relatives aux antiglobulines humaines (AGH)

Les réactifs antiglobulines humaines sont rangés en deux catégories : les antiglobulines polyvalentes et les antiglobulines spécifiques. Les antiglobulines polyvalentes doivent avoir une activité anti-IgG et anti-complément : les antiglobulines spécifiques doivent reconnaître de manière spécifique les composants pour lesquels ils sont désignés "spécifiques". Toutes les antiglobulines doivent répondre aux normes de spécificité et d'activité.

Normes minimales exigibles.

Spécificité :

L'antiglobuline ne doit pas agglutiner, dans la technique choisie, des globules rouges humains mis en présence de sérums humains normaux dépourvus d'anticorps anti-érythrocytaires et des globules rouges humains non sensibilisés, qu'ils soient traités ou non par des enzymes protéolytiques (trypsinés). Ce contrôle devra au total être effectué sur un panel de 10 échantillons de globules rouges dont trois de groupe A, trois de groupe O, deux de groupe B et deux de groupe AB testés contre l'antiglobuline aux dilutions 1/1, 1/2, 1/4.

Le sang destiné à ce panel ne devrait pas être prélevé plus de trois jours auparavant. Les globules rouges doivent être conservés dans leur propre plasma. L'anticoagulant doit être l'ACD, le CPD ou l'EDTA. Le test à l'antiglobuline pratiqué sur ces globules rouges à l'aide d'une antiglobuline connue ne doit pas être positif.

Etude du spectre d'activité :

1° En premier lieu, il ne doit pas exister d'effet de zone ; le titrage de l'antiglobuline ne doit faire apparaître aucune prozone dans un quelconque des systèmes tests ci-après, la prozone étant définie par l'absence d'agglutination à la concentration de la présentation de l'antiglobuline et la présence d'une agglutination aux dilutions suivantes ;

2° En fonction de leur spécificité, les antiglobulines doivent répondre aux caractéristiques suivantes :

Antiglobulines polyvalentes : activité anti-IgG et activité anti-complément conformes aux normes ;

Antiglobulines anti-IgG : activité anti-IgG conforme aux normes et absence d'activité anti-complément ;

Antiglobulines anti-complément : activité anti-complément conforme aux normes et absence d'activité anti-IgG ;

Pour les autres antiglobulines à spectre encore plus étroit, le même type de contrôle doit être effectué pour le respect du spectre.

Les normes minimales sont les suivantes :

Activité anti-IgG.

Activité anti-complément.

Les recommandations techniques de préparation des anticorps de référence et les techniques de sensibilisation sont précisées ci-dessous.

Techniques de sensibilisation :

Pour les anticorps anti-D, anti-Fy a, anti-Jk a et anti-K :

incubation à 37 degrés C durant 45 minutes d'un mélange d'un volume de sérum et un volume de globules rouges en suspension saline à 5 % suivie d'un minimum de trois lavages (sérums traités par EDTA).

Pour l'anti-Lea : l'étape précédente, qui, selon la nature de l'anti-corps pourrait également s'effectuer à 16 degrés C ou à 22 degrés C, sera suivie par l'incubation à 37 degrés C durant 20 minutes des globules rouges ainsi sensibilisés et débarrassés du surnageant sérique après centrifugation, avec 1 ml de complément humain (sérum AB frais). La phase de fixation du complément est identique pour l'anti-Jk a.

Pour la mise en évidence des fractions du C3 et C4, on pratiquera le test au sucrose : à une goutte (50 microns de l) de culot globulaire (pool A, B et O) on ajoute deux gouttes de sérum humain frais sélectionné et 4 ml de la solution suivante : sucrose pur : 6 g ; Nacl : 0,15 g pour 100 ml d'eau distillée. L'ensemble est incubé pendant quinze minutes à 37 degrés C. Les globules rouges sont utilisés après trois lavages. Ils ne doivent pas être autoagglutinables en milieu salin, ni en milieu sérique. Les globules rouges ainsi préparés peuvent alors être incubés en présence de trypsine à 0,1 % à 37 degrés C pendant quinze minutes pour transformer le C3b en C3d et le C4 en C4d. D'autres techniques peuvent être utilisées pour l'analyse spécifique du C3d, C3b. D'autres techniques plus spécifiques peuvent être utilisées.

Les caractéristiques des réactifs utilisés :

Les sérums utilisés pour la sensibilisation in-vitro des globules rouges doivent répondre aux critères maximums d'intensité et de titre, indiqués dans le tableau suivant :

Ces valeurs doivent être obtenues par la technique de test à l'antiglobuline utilisant une antiglobuline conforme, servant de référence et conservé au CNRGS. Les dilutions des sérums pour le titrage se font en saline. Pour les sérums anti-Le a et anti-Jk a, il est nécessaire, au terme du temps de sensibilisation, de retirer après centrifugation le surnageant sérique et de le remplacer par un volume égal de sérum AB frais, source de complément. Les lavages et le test à l'antiglobuline proprement dit n'interviendront qu'après vingt minutes d'incubation supplémentaire à 37 degrés C de ce nouveau mélange.

Les techniques du test à l'antiglobuline proprement dit et du contrôle de la spécificité du réactif AGH sont celles décrites dans l'annexe I.

Instructions relatives à l'étude préliminaire des anticoprs produits "in vitro"

L'analyse préalable porte essentiellement sur la spécificité de l'anticorps (monoclonal ou non) ; si le producteur se propose de distribuer un mélange d'anticorps monoclonaux, cette étude devra au moins être réalisée avec le mélange et également au mieux avec chaque anticorps monoclonal. Cette étude comportera :

1° L'analyse de la spécificité anticorps sur un panel d'hématies-tests comportant au moins 100 globules rouges tests informatifs, et selon un éventail élargi de techniques.

2° L'analyse de la spécificité anticorps, par des méthodes compatibles avec le système de groupes sanguins considéré, de manière à préciser au mieux l'épitope reconnu.

3° Les conditions et durées de conservation du réactif ; cette étude peut être réalisée selon des protocoles de vieillissement accéléré. Elle doit permettre de fixer ultérieurement la durée, de validité du réactif.

4° L'analyse, dans les conditions recommandées d'utilisation, d'une population de donneurs de sang déjà connus pour la spécificité considérée. La taille minimum de l'échantillon est fonction des antigènes étudiés : 15.000 individus pour les spécificités A, B, A + B, D et les immunoglobulines humaines, 1.500 individus pour les autres spécificités. La notice d'utilisation devra faire référence à cette étude.

5° Les normes fixées sont identiques à celles de réactifs d'autre origine précisées dans les annexes I et II du présent arrêté, les titres et performances sont déterminés à l'aide de milieux de dilution précisés par l'établissement producteur.