1. Objet.

La préparation de l'échantillon pour essai a pour objet l'obtention d'un échantillon suffisamment homogène permettant des prises d'essai représentatives des laits fermentés et des yaourts en vue de la mise en oeuvre des méthodes d'analyse décrites ci-après.

2. Mode opératoire.

Rendre l'échantillon homogène par agitation modérée à l'aide d'une spatule. Réincorporer si nécessaire le lactosérum exsudé. Dans le cas des yaourts aux fruits, broyer et homogénéiser l'échantillon dans un appareil approprié.

1. Définition.

L'acidité titrable est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée conventionnellement en pourcentage en masse d'acide lactique.

2. Principe.

Titrage potentiométrique de l'acidité jusqu'à pH 8,3 à l'aide d'une solution titrée d'hydroxyde de sodium.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

3.1. Solution titrée d'hydroxyde de sodium 0,1 M.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire et, notamment :

4.1. pH mètre équipé d'une électrode spécifique, étalonné à l'aide de solutions-tampon à pH 7,00 et 9,00 par exemple.

5. Mode opératoire.

5.1. Peser dans un bécher de 50 ml, à 10 mg près, environ 10 g de l'échantillon pour essai. Ajouter environ 10 ml d'eau.

5.2. Introduire les électrodes du pH mètre (4.1). Veiller à ce qu'elles soient immergées.

5.3. Titrer sous agitation par la solution d'hydroxyde de sodium (3.1) jusqu'à pH 8,3.

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule.

L'acidité exprimée en acide lactique, est donnée par la relation suivante :

Acidité en % m/m = V . 0,9m / m

où

V est le volume, en millilitre, de la solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M utilisé en 5.3 ;

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai (5.1).

6.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 0,05.

1. Définition.

La teneur en matière grasse est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en pourcentage en masse.

2. Principe.

Attaque par l'acide chlorhydrique. Séparation de l'insoluble par filtration suivie de séchage. Extraction de la matière grasse par l'oxyde diéthylique. Evaporation du solvant et pesée du résidu.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit avoir un titre hydrotimétrique supérieur à 5° (eau de canalisation).

3.1. Acide chlorhydrique (r 20 = 1,125).

3.2. Oxyde diéthylique.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire et, notamment :

4.1. Béchers de 150 ml.

4.2. Verres de montre de diamètre approprié.

4.3. Bain d'eau bouillante.

4.4. Entonnoirs en verre, diamètre 90 mm.

4.5. Papiers filtres plats sans graisse, diamètre 150 mm.

4.6. Appareil approprié à extraction continue.

4.7. Fioles de 125 ml à 200 ml s'adaptant à l'appareil (4.6).

4.8. Etuve à 103 7 2 °C.

5. Mode opératoire.

5.1. Attaque chlorhydrique :

Dans un bécher (4.1) peser à 1 mg près environ 10 g d'échantillon pour essai. Ajouter 50 ml d'acide chlorhydrique (3.1). Couvrir le bécher d'un verre de montre (4.2) et le placer sur l'orifice du bain d'eau (4.3).

Laisser trente à quarante minutes en agitant de temps en temps.

Rincer ensuite les parois du bécher et le verre de montre avec 20 à 30 ml d'eau chaude.

5.2. Filtration :

Disposer dans un entonnoir (4.4) deux filtres plats (4.5) emboîtés de manière à répartir uniformément les couches de papier. Mouiller les filtres avec de l'eau. Filtrer le contenu chaud du bécher.

Laver le bécher et les filtres à l'eau bouillante jusqu'à neutralité des dernières eaux de lavage. Ce résultat est généralement atteint avec 250 ml d'eau. Il est recommandé de ne pas dépasser 400 ml de filtrat. Laisser égoutter les filtres, puis les sécher complètement soit à l'air libre, soit à l'étuve (4.8) pendant une heure. A cet effet, les filtres peuvent être laissés dans l'entonnoir en les décollant de la paroi ou être transférés dans un cristallisoir à bec de 100 mm de diamètre. Sécher de même le bécher utilisé.

5.3. Extraction :

Peser à 1 mg près une fiole (4.7) préalablement séchée à l'étuve et refroidie en dessiccateur. Envelopper le double filtre dans un filtre neuf et l'introduire dans la cellule d'extraction de l'appareil (4.6). Mettre en place la fiole (4.7). Rincer avec le solvant (3.2) l'entonnoir et le critallisoir ainsi que le bécher (4.1) séché, en introduisant ce solvant dans l'appareil.

Ajouter du solvant en quantité appropriée aux dimensions de l'appareil et procéder à l'extraction pendant quatre heures.

Distiller la presque totalité du solvant de la fiole (4.7). Eliminer par évaporation la plus grande partie du solvant résiduel.

Placer la fiole en position inclinée dans l'étuve (4.8) et l'y maintenir pendant quarante-cinq minutes.

Laisser refroidir la fiole dans un dessiccateur jusqu'à température ambiante, peser à 1 mg près.

Reprendre la séquence séchage-refroidissement-pesée jusqu'à ce que deux pesées successives ne diffèrent pas de plus de 1 mg.

Généralement, un seul séjour de quarante-cinq minutes à l'étuve est suffisant. Dans le cas d'une reprise de masse par oxydation, le chiffre à retenir est celui de la masse minimale.

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule :

La teneur en matière grasse est donnée par la relation suivante :

Matière grasse en % m/m = (m1 - m0) . 100 / m

où

m0 est la masse, en gramme, de la fiole (4.7) vide ;

m1 est la masse, en gramme, de la fiole (4.7) contenant la matière grasse extraite ;

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai 5.1.

6.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 0,05.

1. Définition.

La teneur en azote total est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en pourcentage en masse.

2. Principe.

Minéralisation selon la méthode de Kjeldahl, distillation après alcalinisation et titrimétrie de l'hydroxyde d'ammonium formé.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

3.1. Acide sulfurique solution titrée 0,05 M.

3.2. Acide sulfurique concentré (r20 = 1,83).

3.3. Hydroxyde de sodium, solution concentrée (r20 = 1,33).

3.4. Solution d'acide borique et d'indicateur :

Dissoudre 40 g d'acide borique dans un litre d'eau bouillante. Après refroidissement, ajouter 10 ml d'une solution d'indicateur approprié (par exemple, dissoudre, dans 100 ml d'éthanol à 70 p. 100 vol., 0,01 g de rouge de méthyle, 0,06 g de vert de bromocrésol et 0,02 g de bleu de bromothymol).

3.5. Mélange catalyseur :

Sulfate de cuivre cristallisé Cu SO4, 5 H2 O : 10 g ;

Sulfate de potassium K2 SO4 : 100 g.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Matras de Kjeldahl de 300 ml et boule pédiculée ou appareil muni d'un dispositif d'absorption de vapeur.

4.2. Dispositif de chauffage permettant la minéralisation.

4.3. Appareil pour distillation de l'ammoniac, de préférence par entraînement à la vapeur d'eau.

4.4. pH mètre avec électrode spécifique.

5. Mode opératoire.

5.1. Prise d'essai :

Peser rapidement, à 1 cg près, 2 à 3 g d'échantillon pour essai dans une nacelle appropriée.

Introduire cette prise d'essai dans le dispositif de minéralisation (4.1).

5.2. Minéralisation :

Ajouter 5 à 6 g de catalyseur (3.5), 20 ml d'acide sulfurique concentré (3.2) et une bille de verre de 5 à 7 mm de diamètre. Agiter et placer ensuite le matras sur le dispositif de chauffage (4.2). Chauffer d'abord doucement en agitant de temps en temps. Lorsque l'eau s'est évaporée, augmenter le chauffage jusqu'à ébullition modérée du mélange acide et, lorsque des fumées blanches commencent à se produire, obturer le col du matras avec la boule pédiculée ou le raccorder à un dispositif d'absorption des vapeurs. Agiter de temps en temps de façon à ramener dans le fond du matras les parcelles de substances qui adhèrent aux parois.

Lorsque le liquide est devenu limpide, régler le chauffage de manière à condenser les vapeurs d'acide vers le milieu du col du matras et poursuivre le chauffage pendant au moins quatre-vingt-dix minutes.

Laisser refroidir le matras obturé pour éviter un contact éventuel avec les vapeurs ammoniacales présentes dans le laboratoire. Ainsi protégé, le matras peut être conservé quelque temps en attendant la distillation de l'ammoniac.

5.3. Distillation et dosage de l'ammoniac :

Il y a intérêt à conduire simultanément ces deux opérations pour apprécier avec netteté la fin de l'entraînement de l'ammoniac. Si on utilise l'entraînement par la vapeur d'eau, le matras de minéralisation pourra être adapté directement à l'appareil.

Diluer le contenu du matras par addition de 30 à 50 ml d'eau qui servent en même temps à rincer les parois du col du matras et la boule pédiculée.

Laisser refroidir.

Placer un bécher de 400 ml dans lequel on aura introduit environ 40 ml de la solution d'acide borique et d'indicateur (3.4), sur un agitateur magnétique et de façon que l'extrémité de l'allonge du réfrigérant plonge dans la solution (3.4).

Raccorder le matras de minéralisation à l'appareil à entraînement à la vapeur d'eau (4.3). Alcaliniser le contenu du matras en introduisant lentement, en agitant, 70 à 80 ml de la solution concentrée d'hydroxyde de sodium (3.3).

Effectuer la distillation dans les conditions prévues pour l'appareil utilisé. L'entraînement de l'ammoniac commence presque aussitôt et se fait très rapidement, aussi l'indicateur contenu dans le becher vire à sa teinte alcaline (bleu-vert).

Recueillir environ 200 ml de distillat, le becher contient alors un volume total voisin de 250 ml. Titrer par la solution (3.1) jusqu'à pH 4,7 7 0,1 ou jusqu'à l'apparition d'une teinte identique à celle d'un témoin obtenu dans les mêmes conditions.

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule :

La teneur en azote total est donnée par la relation suivante :

Azote total en % m/n = V . 0,14m / m

où

V est le volume, en millilitre, de la solution d'acide sulfurique (3.1) utilisé en 5.3 ;

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai 5.1.

6.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 0,01.

6.3. Remarque.

Par convention, le résultat peut être exprimé en matières protéiques totales en multipliant le chiffre d'azote total par le coefficient 6,38.

7. Essais.

7.1. Essai à blanc.

Cet essai doit être effectué pour chaque série d'analyses.

L'essai à blanc comporte tous les temps du mode opératoire en remplaçant la prise d'essai par 0,1 g de saccharose en solution dans 5 ml d'eau distillée. Il doit nécessiter un très faible volume de solution (3.1) qui sera pris en compte pour corriger le volume V en 6.1.

7.2. Essais témoins.

7.2.1. Contrôle du rendement de distillation.

Introduire dans le matras une quantité connue d'un sel d'ammonium de qualité analytique, par exemple 0,150 g de sulfate d'ammonium.

Suivre le mode opératoire décrit à partir de 5.3 ; toutefois, l'alcalinisation doit être effectuée avec environ 20 ml d'hydroxyde de sodium (3.3). Le pourcentage d'azote trouvé par rapport à la valeur théorique doit être supérieur à 99 p. 100.

7.2.2. Contrôle du rendement de minéralisation.

Faire un essai en utilisant 0,200 g de tryptophane de qualité analytique et suivre le mode opératoire décrit à partir de 5.2. Le pourcentage d'azote trouvé par rapport à la valeur théorique doit être supérieur à 98 p. 100.

1. Objet et domaine d'application.

Cette méthode a pour objet de décrire une technique enzymatique permettant de déterminer spécifiquement la teneur en lactose des laits fermentés et des yaourts en présence d'autres glucides et de substances réductrices.

Cette méthode est applicable à tous les produits lactés sucrés.

2. Définition.

La teneur en lactose est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en pourcentage en masse.

3. Principe.

3.1. Défécation.

Précipitation de la matière grasse et des protéines par addition d'hexacyanoferrate de potassium et de sulfate de zinc. L'excès d'ions Zn++ présent est précipité en milieu alcalin puis éliminé par filtration.

3.2. Dosage enzymatique.

Le lactose est hydrolysé en glucose et b-galactose en présence de bêta-galactosidase.

Lactose + H20 / bêta-galactosidase glucose + bêta-galactose

Le b-galactose est oxydé par la nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) en acide galactonique en présence de b-galactose déshydrogénase (Gal-DH) :

bêta-galactose + NAD + / Gal - DH ac. galactonique + NADH + H +

La quantité de NADH formée au cours de la réaction est proportionnelle à la quantité de lactose. Elle est mesurée au spectrophotomètre à 340 nm contre l'air.

4. Réactifs.

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée pour la préparation des solutions d'enzymes et des échantillons doit être d'une pureté au moins égale à celle de l'eau bidistillée sur verre.

4.1. Solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium.

Dissoudre 15 g d'hexacyanoferrate (II) de potassium dans l'eau et compléter à 100 ml.

4.2. Solution de sulfate de zinc.

Dissoudre 30 g de sulfate de zinc (ZnSO4, 7H2O) dans l'eau et compléter à 100 ml.

4.3. Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M.

Dissoudre 4,00 g d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans l'eau et compléter à 1 000 ml.

4.4. Tampon citrate pH 6,6.

Dissoudre 2,8 g de citrate trisodique dihydraté (C6H5 Na3O7, 2H20), 0,625 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4, 7H2O) dans environ 40 ml d'eau. Ajuster à pH 6,6 avec une solution d'acide sulfurique environ 2 M ou une solution d'hydroxyde de sodium environ 1 M. Compléter à 50 ml avec de l'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

4.5. Suspension de b-galactosidase (d'E. coli) dans une solution de sulfate d'ammonium 2,2 M, pH environ 6.

L'activité spécifique de la suspension de b-galactosidase (EC 3.2.1.23) doit être d'au moins 150 U/ml à 25 °C avec le lactose comme substrat.

Conservation douze mois à + 4 °C.

4.6. Tampon phosphate pH 8,6.

Dissoudre 8,3 g d'hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4) dans environ 40 ml d'eau. Ajuster à pH 8,6 avec une solution d'acide sulfurique (H2SO4) environ 2 M ou une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) environ 1 M.

Compléter à 50 ml avec de l'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

4.7. Suspension de galactose-déshydrogénase (de Ps. fluorescens) dans une solution de sulfate d'ammonium 2,2 M, pH environ 6.

L'activité spécifique de la suspension de galactose-déshydrogénase (EC 1.1.1.48) doit être d'au moins 25 U/ml à 25 °C avec le galactose comme substrat.

4.8. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD).

Dissoudre 100 mg de NAD dans 10 ml d'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

4.9. Solution de lactose hydraté.

Dissoudre dans l'eau 4,5 g de lactose (C12H22O11, H2O) préalablement séché à masse constante à 87 °C, et compléter à 100 ml.

5. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire et notamment :

5.1. Balance analytique.

5.2. Bécher d'une capacité de 50 ml.

5.3. Fiole jaugée d'une capacité de 100 ml, classe B.

5.4. Pipettes de précision permettant de délivrer 2 - 1 - 0,2 - 0,05 et 0,02 ml.

5.5. Pipettes de 5 ml graduées au 1/10.

5.6. Entonnoir, diamètre 7 cm.

5.7. Papier filtre, diamètre 15 cm, Whatman n° 40 ou équivalent.

5.8. Film plastique étirable (type parafilm) pour obturation des cuves.

5.9. Spectrophotomètre réglé à 340 nm et équipé de cuves de 10 mm de parcours optique.

6. Mode opératoire.

6.1. Essai de contrôle.

Si un nouveau lot de réactifs (4.4 à 4.9 inclus) est utilisé, si les réactifs ont été conservés au réfrigérateur sans avoir été utilisés pendant plus de deux semaines, si le travail analytique recommence après une période d'inactivité ou si d'autres conditions peuvent le justifier, l'essai de contrôle suivant doit être effectué.

6.1.1. Introduire, à la pipette, 1 ml de la solution de lactose (4.9) dans deux fioles jaugées de 100 ml (5.3) et déterminer la teneur en lactose dans les deux fioles jaugées en appliquant le mode opératoire décrit en 6.3.2, 6.3.3, 6.4 et 6.6.

6.1.2. Calculer la teneur en lactose exprimée en gramme pour 100 ml selon la formule suivante :

18,873 . delta A

delta A est la différence d'absorbance à 340 nm calculée comme indiqué au point 6.6.

6.1.3. Compte tenu de la pureté du lactose, la valeur retrouvée dans chacune des fioles doit être de 100 7 2 %.

Dans le cas contraire, les réactifs, le mode opératoire, la précision des pipettes, les conditions d'utilisation du spectrophotomètre doivent être vérifiés et les corrections adéquates effectuées. L'essai de contrôle doit être répété jusqu'à obtention de résultats satisfaisants.

6.2. Prise d'essai.

Peser, 1 mg près dans le bécher (5.2), 0,7 à 0,8 g de l'échantillon pour essai.

6.3. Préparation de la solution à doser.

6.3.1. Diluer la prise d'essai dans environ 20 ml d'eau chaude (40 à 50 °C) tout en remuant avec une baguette en verre.

Verser quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée (5.3).

6.3.2. Ajouter à la solution (6.3.1) dans l'ordre suivant : 1,0 ml de la solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium (4.1), 1,0 ml de la solution de sulfate de zinc (4.2) et 5,0 ml de la solution d'hydroxyde de sodium (4.3), en mélangeant soigneusement après chaque addition. Refroidir le contenu de la fiole à environ 20 °C. Compléter à 100 ml avec de l'eau, mélanger.

6.3.3. Après trente minutes environ, filtrer sur papier filtre (5.7).

Rejeter les premiers millilitres de filtrat.

6.4. Essai à blanc.

Effectuer un essai à blanc en appliquant le mode opératoire décrit à partir de 6.3 en utilisant tous les réactifs mais en remplaçant la prise d'essai par de l'eau.

6.5. Solution étalon de lactose.

Effectuer un essai avec 1 ml de solution standard (4.9) en appliquant le mode opératoire décrit à partir de 6.3.

6.6. Détermination.

Introduire à la pipette dans trois cuves de mesure (5.9) les filtrats ou les réactifs selon les indications portées dans le tableau ci-après, toutes les mesures étant effectuées contre l'air.

La quantité de lactose dans la cuve du spectrophotomètre doit être comprise entre 5 et 50 mg.

(tableau non reproduit, voir au Journal officiel).

1. Objet et domaine d'application.

Cette méthode a pour objet de décrire les techniques enzymatiques permettant de déterminer spécifiquement les teneurs en saccharose, glucose et fructose des yaourts sucrés, aromatisés sucrés et aux fruits.

Cette méthode est applicable à tous les produits lactés sucrés.

2. Définition.

Les teneurs en saccharose, glucose et fructose sont les résultats obtenus par l'application de la méthode décrite ci-après. Elles sont exprimées en pourcentage en masse.

3. Principe.

3.1. Défécation.

Précipitation de la matière grasse et des protéines par addition d'hexacyanoferrate de potassium et de sulfate de zinc. L'excès d'ions Zn++ présent est précipité en milieu alcalin puis éliminé par filtration.

3.2. Dosages enzymatiques.

3.2.1. Dosage du glucose avant et après hydrolyse enzymatique du saccharose.

3.2.1.1. Dosage du glucose.

Le glucose est phosphorylé à pH 7,6 par l'adénosine-5'-triphosphate (ATP) en glucose-6-phosphate (G-6-P) avec formation d'adénosine-5'-diphosphate (ADP) dans une réaction catalysée par l'hexokinase (HK) :

Glucose + ATP / HK G6P + ADP

En présence de glucose-6-phosphate-déshydrogénase (G6P-DH), le glucose-6-phosphate est oxydé par la nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP) en gluconate-6-phosphate. Il se forme du nicotinamide-adénine- dinucléotide-phosphate réduit (NADPH) :

G6P + NADP+ / G6P-DH gluconate 6-P + NADPH + H+

La quantité de NADPH formée au cours de la réaction est proportionnelle à la quantité de glucose. Elle est mesurée au spectrophotomètre à 340 nm contre l'air.

3.2.1.2. Dosage du saccharose.

Le saccharose est hydrolysé à pH 4,6 par la b-fructosidase en glucose et fructose :

Saccharose + H2O / bêta-fructosidase glucose + fructose

Le dosage du glucose après inversion (glucose total) se fait parallèlement selon le procédé décrit plus haut. La différence entre le glucose avant et après inversion enzymatique permet de calculer la teneur en saccharose.

3.2.2. Dosage du fructose.

Le fructose est phosphorylé par l'adénosine-5'-triphosphate (ATP) en fructose-6-phosphate (F-6-P) avec formation d'adénosine-5'-diphosphate (ADP) dans une réaction catalysée par l'hexokinase (HK) :

Fructose + ATP / HK F-6-P + ADP

Le F-6-P est transformé en glucose-6-phosphate par la phosphoglucose-isomérase (PGI) :

F-6-P / PGI G-6-P

Le G-6-P formé réagit avec le NADP en formant du gluconate-6- phosphate et du NADPH. La quantité de NADPH formée au cours de la réaction est proportionnelle à la quantité de fructose. Elle est mesurée au spectrophotomètre à 340 nm contre l'air.

4. Réactifs.

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique.

L'eau utilisée pour la préparation des solutions d'enzymes et des échantillons doit être d'une pureté au moins égale à celle de l'eau bidistillée sur verre.

4.1. Solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium.

Dissoudre 15 g d'hexacyanoferrate (II) de potassium (K4Fe(CN)6,3H2O) dans l'eau et compléter à 100 ml.

4.2. Solution de sulfate de zinc.

Dissoudre 30 g de sulfate de zinc (ZnSO4, 7H2O) dans l'eau et compléter à 100 ml.

4.3. Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M.

Dissoudre 4,00 g d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans l'eau et compléter à 1 000 ml.

4.4. Tampon triéthanolamine pH 7,6.

Dissoudre 14,0 g de chlorhydrate de triéthanolamine (C6 H15 NO3, HC1). 0,25 g de sulfate de magnésium (MgSO4, 7H2O) dans environ 80 ml d'eau. Ajuster à pH 7,6 avec une solution d'hydroxyde de sodium environ 5 M. Compléter à 100 ml avec de l'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

Réchauffer à environ 25 °C au moment de l'emploi.

4.5. Tampon citrate pH 4,6.

Dissoudre 6,9 g d'acide citrique (C6H8O7,H2O) et 9,1 g de citrate trisodique (C6 H5 Na3 O7, 2 H2O) dans environ 150 ml d'eau. Ajuster à pH 4,6 avec une solution d'hydroxyde de sodium environ 2 M.

Compléter à 200 ml avec de l'eau.

Conservation un an à + 4 °C.

4.6. b-fructosidase (5 mg/ml).

Dissoudre 10 mg de b-fructosidase dans 2 ml de tampon citrate (4.5).

Conservation un an à + 4 °C.

4.7. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP).

Dissoudre 100 mg de NADP-Na2 dans 10 ml d'eau.

Conservation un an à + 4 °C.

4.8. Solution d'adénosine-5'-triphosphate (ATP).

Dissoudre 500 mg d'ATP - Na2 H2, 3H2 O et 500 mg d'hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) dans 10 ml d'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

4.9. Hexokinase/glucose-6-phosphate-déshydrogénase (2mg HK/ml.1mg G-6-PDH/ml), en suspension dans une solution de sulfate d'ammonium 3,2 M.

Conservation un an à + 4 °C.

4.10. Phosphoglucose isomérase (P.G.I.) (2 mg/ml), en suspension dans une solution de sulfate d'ammonium 3,2 M.

L'activité spécifique de la suspension de phosphoglucose isomérase (E.C. 5.3.1.9) doit être d'au moins 350 U/mg à 25 °C avec le fructose-6-phosphate comme substrat.

Conservation un an à + 4 °C.

4.11. Solution de saccharose, glucose, fructose.

Dissoudre 10,000 g de saccharose (C12 H22 O11), 1,000 g de glucose anhydre (C6 H12 O6) et 1,000 g de fructose (C6 H12 O6) dans l'eau et compléter à 100 ml.

5. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

5.1. Balance analytique.

5.2. Bécher d'une capacité de 50 ml.

5.3. Fiole jaugée d'une capacité de 100 ml, classe B.

5.4. Pipettes de précision permettant de délivrer 2-1-0,2-0,05 et 0,02 ml.

5.5. Pipettes de 5 ml graduées au 1/10.

5.6. Entonnoir, diamètre 7 cm.

5.7. Papier filtre, diamètre 15 cm, Whatman n° 40 ou équivalent.

5.8. Film plastique étirable (Type parafilm) pour obturation des cuves.

5.9. Spectrophotomètre réglé à 340 nm et équipé de cuves de 10 mm de parcours optique.

6. Mode opératoire.

6.1. Essai de contrôle.

Si un nouveau lot de réactifs (4.4 à 4.10 inclus) est utilisé, si les réactifs ont été conservés au réfrigérateur sans avoir été utilisés pendant plus de deux semaines, si le travail analytique recommence après une période d'inactivité ou si d'autres conditions peuvent le justifier, l'essai de contrôle suivant doit être effectué.

6.1.1. Introduire à la pipette, 1 ml de la solution de sucres (4.11) dans deux fioles jaugées de 100 ml (5.3) et déterminer la teneur en sucres dans les deux fioles jaugées en appliquant le mode opératoire décrit en 6.3.2, 6.3.3, 6.4 et 6.6.

6.1.2. Calculer les teneurs respectives en glucose, saccharose et fructose exprimées en grammes pour 100 ml selon les formules suivantes :

glucose = delta Ä 9,267

saccharose = delta Ä 17,604

fructuose = delta Ä 9,325

delta A est la différence d'absorbance à 340 nm, calculée comme indiqué au point 6.6.

6.1.3. Compte tenu de la pureté du saccharose, du glucose et du fructose, la valeur retrouvée pour chaque sucre et dans chacune des fioles doit être de 100 7 2 p. 100.

Dans le cas contraire, les réactifs, le mode opératoire, la précision des pipettes, les conditions d'utilisation du spectrophotomètre doivent être vérifiés et les corrections adéquates effectuées.

L'essai de contrôle doit être répété jusqu'à obtention de résultats satisfaisants.

6.2. Prise d'essai.

Peser, à 1 mg près, dans le bécher (5.2) 0,7 à 0,8 g de l'échantillon pour essai.

6.3. Préparation de la solution à doser.

6.3.1. Diluer la prise d'essai dans environ 20 ml d'eau chaude (40 à 50 °C) tout en remuant avec une baguette en verre. Verser quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée (5.3).

6.3.2. Ajouter à la solution (6.3.1) dans l'ordre suivant :

1,0 ml de la solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium (4.1), 1,0 ml de la solution de sulfate de zinc (4.2) et 5,0 ml de la solution d'hydroxyde de sodium (4.3), en mélangeant soigneusement après chaque addition. Refroidir le contenu de la fiole à environ 20 °C. Compléter à 100 ml avec de l'eau, mélanger.

6.3.3. Après trente minutes environ, filtrer sur papier filtre (5.7).

Rejeter les premiers millilitres de filtrat.

6.4. Essai à blanc.

Effectuer un essai à blanc en appliquant le mode opératoire décrit à partir de 6.3, en utilisant tous les réactifs mais en remplaçant la prise d'essai par de l'eau.

6.5. Solution étalon de glucose-saccharose-fructose.

Effectuer un essai avec 1 ml de solution étalon (4.11) en appliquant le mode opératoire décrit à partir de 6.3.

6.6. Détermination.

Introduire à la pipette dans six cuves de mesure (5.9) les filtrats ou les réactifs selon les indications portées dans le tableau ci-après, toutes les mesures étant effectuées contre l'air.

La quantité de sucres (glucose + saccharose + fructose) dans la cuve du spectrophotomètre doit être comprise entre 3 mg et 100 mg.

(tableau non reproduit, voir au Journal officiel).

1. Si les réactions ne sont pas terminées après 15 minutes, continuer à lire les absorbances de 5 en 5 minutes jusqu'à ce que l'augmentation de l'extinction en 5 minutes soit constante. Extrapoler les absorbances au temps de l'addition de la dernière suspension.

2. Si l'absorbance en A2 excède celle mesurée en A1 de plus de 0,5 , répéter la détermination 6.6 sur une dilution adéquate du filtrat (6.3.3).

Les différences d'absorbance correspondant aux teneurs en glucose, saccharose et fructose, de l'échantillon pour essai ou de la solution étalon dans la cuve réactionnelle sont égales à :

delta A glucose étalon = (AGT2 - AGT1) - (AGB2 - AGB1) ;

delta A glucose échantillon = (AGE2 - AGE1) - (AGB2 - AGB1) ;

N Asaccharose étalon

= <(AST2 - AST1) - (ASB2 - ASB1)> - ;

delta A saccharose échantillon

= <(ASE2 - ASE1) - (ASB2 - ASB1)> - ;

delta A fructose étalon = (AGT3 - AGT2) - (AGB3 - AGB2) ;

delta A fructose échantillon = (AGE3 - AGE2) - (AGB3 - AGB2).

Il est nécessaire d'effectuer toutes les mesures en double et de prendre la moyenne arithmétique des différences d'absorbance si elles sont très peu différentes, sinon répéter les mesures.

7. Expression des résultats.

7.1. Teneur en glucose.

7.1.1. Mode de calcul et formule.

La teneur en glucose est donnée par la relation suivante :

Glucose % m/m = delta A glucose échantillon / delta A glucose étalon C / m

où

C est la concentration en glucose de la solution étalon égale à 1 (4.11) ;

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai (6.2).

7.1.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre, par le même analyste ne doit pas excéder 0,1.

7.2. Teneur en saccharose.

7.2.1. Mode de calcul et formule.

La teneur en saccharose est donnée par la relation suivante :

Saccharose % m/m = delta A saccharose échantillon / delta A saccharose étalon C / m

où

C est la concentration en saccharose de la solution étalon égale à 10 (4.11) ;

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai (6.2).

7.2.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre, par le même analyste ne doit pas excéder 0,2.

7.3. Teneur en fructose.

7.3.1. Mode de calcul et formule.

La teneur en fructose est donnée par la relation suivante :

Fructose % m/m = delta A fructose échantillon / delta A fructose étalon C / m

où

C est la concentration en fructose de la solution étalon égale à 1 (4.11) ;

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai (6.2).

7.3.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre, par le même analyste ne doit pas excéder 0,2.

1. Objet et domaine d'application.

Cette méthode a pour objet de décrire une technique permettant de déterminer la teneur en acide sorbique des laits fermentés et des yaourts aux fruits.

2. Définition.

La teneur en acide sorbique est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en milligramme par kilogramme.

3. Principe.

Extraction de l'acide sorbique en milieu acide par entraînement à la vapeur. Séparation et dosage par chromatographie liquide haute performance en phase inversée.

4. Réactifs.

Les réactifs utilisés doivent être de pureté analytique. L'eau doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

4.1. Acide orthophosphorique à 85 p. 100 m/m.

4.2. Méthanol pour chromatographie liquide haute performance.

4.3. Solution tampon acétate d'ammonium 0,005 M à pH 4,4 :

Dissoudre 0,385 g d'acétate d'ammonium dans un litre d'eau.

Ajuster à pH 4,4 à l'aide d'acide acétique.

4.4. Solution de sorbate de potassium à 133,9 mg/l (soit 100 mg d'acide sorbique par litre).

5. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

5.1. Appareil de chromatographie liquide haute performance équipé :

- d'une colonne en acier inox de 4 mm de diamètre intérieur et de 15 à 25 cm de longueur, garnie de silice greffée C8 ou C18 ;

- d'un détecteur spectrophotomètre réglé à 254 nm.

5.2. Appareil pour entraînement à la vapeur d'eau.

5.3. Dispositif de filtration muni d'une membrane filtrante de 0,45 mm de diamètre de pore.

6. Mode opératoire.

6.1. Extraction.

Peser à 0,1 g près, dans un récipient pouvant s'adapter à l'appareil (4.2), 20 g environ de l'échantillon pour essai.

Ajouter 30 ml d'eau et 5 ml d'acide orthophosphorique (4.1).

Adapter à l'appareil (5.2), entraîner à la vapeur et recueillir 500 ml de distillat dans une fiole jaugée.

6.2. Courbe d'étalonnage.

Entraîner à la vapeur selon 6.1, 10, 20 et 30 ml de la solution (4.4). Les distillats obtenus, contenant respectivement 2, 4 et 6 mg/l d'acide sorbique, sont injectés dans l'appareil (5.1).

Les conditions opératoires sont, à titre indicatif :

- colonne de 15 cm garnie de silice greffée C8 (dp = 7mm) ;

- phase mobile : 50 volumes de méthanol (4.2), 50 volumes de solution (4.3) ;

- débit : 1,5 ml/minute ;

- volume d'injection : 20 ml ;

- détection à 254 nm ;

- temps de rétention : 8 minutes environ.

Mesurer l'aire ou la hauteur du pic et tracer la courbe en fonction des concentrations des solutions-étalons.

6.3. Identification et dosage.

Filter sur le dispositif (5.3) le distillat obtenu en 6.1.

Injecter 20 ml de filtrat dans l'appareil (5.1).

Mesurer l'aire ou la hauteur du pic de l'acide sorbique identifié par son temps de rétention.

Déterminer sur la courbe obtenue en 6.2 la concentration du filtrat.

7. Expression des résultats.

7.1. Mode de calcul et formule.

La teneur en acide sorbique est donnée par la relation suivante :

Acide sorbique mg/kg = C.500 / m

où

C est la concentration, en milligramme, par litre déterminée en 6.3.,

m est la masse, en gramme, de la prise d'essai (6.1).

7.2. Répétabilité.

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste ne doit pas excéder 3.

Nota - On peut identifier et doser l'acide benzoïque dans les mêmes conditions opératoires en réglant le spectrophotomètre à 227 nm. Temps de rétention : six minutes environ.