1. Objet et domaine d'application.

Cette méthode a pour objet de décrire les techniques enzymatiques permettant de déterminer spécifiquement les teneurs en saccharose, glucose et fructose des yaourts sucrés, aromatisés sucrés et aux fruits.

Cette méthode est applicable à tous les produits lactés sucrés.

2. Définition.

Les teneurs en saccharose, glucose et fructose sont les résultats obtenus par l'application de la méthode décrite ci-après. Elles sont exprimées en pourcentage en masse.

3. Principe.

3.1. Défécation.

Précipitation de la matière grasse et des protéines par addition d'hexacyanoferrate de potassium et de sulfate de zinc. L'excès d'ions Zn++ présent est précipité en milieu alcalin puis éliminé par filtration.

3.2. Dosages enzymatiques.

3.2.1. Dosage du glucose avant et après hydrolyse enzymatique du saccharose.

3.2.1.1. Dosage du glucose.

Le glucose est phosphorylé à pH 7,6 par l'adénosine-5'-triphosphate (ATP) en glucose-6-phosphate (G-6-P) avec formation d'adénosine-5'-diphosphate (ADP) dans une réaction catalysée par l'hexokinase (HK) :

Glucose + ATP / HK G6P + ADP

En présence de glucose-6-phosphate-déshydrogénase (G6P-DH), le glucose-6-phosphate est oxydé par la nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP) en gluconate-6-phosphate. Il se forme du nicotinamide-adénine- dinucléotide-phosphate réduit (NADPH) :

G6P + NADP+ / G6P-DH gluconate 6-P + NADPH + H+

La quantité de NADPH formée au cours de la réaction est proportionnelle à la quantité de glucose. Elle est mesurée au spectrophotomètre à 340 nm contre l'air.

3.2.1.2. Dosage du saccharose.

Le saccharose est hydrolysé à pH 4,6 par la b-fructosidase en glucose et fructose :

Saccharose + H2O / bêta-fructosidase glucose + fructose

Le dosage du glucose après inversion (glucose total) se fait parallèlement selon le procédé décrit plus haut. La différence entre le glucose avant et après inversion enzymatique permet de calculer la teneur en saccharose.

3.2.2. Dosage du fructose.

Le fructose est phosphorylé par l'adénosine-5'-triphosphate (ATP) en fructose-6-phosphate (F-6-P) avec formation d'adénosine-5'-diphosphate (ADP) dans une réaction catalysée par l'hexokinase (HK) :

Fructose + ATP / HK F-6-P + ADP

Le F-6-P est transformé en glucose-6-phosphate par la phosphoglucose-isomérase (PGI) :

F-6-P / PGI G-6-P

Le G-6-P formé réagit avec le NADP en formant du gluconate-6- phosphate et du NADPH. La quantité de NADPH formée au cours de la réaction est proportionnelle à la quantité de fructose. Elle est mesurée au spectrophotomètre à 340 nm contre l'air.

4. Réactifs.

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique.

L'eau utilisée pour la préparation des solutions d'enzymes et des échantillons doit être d'une pureté au moins égale à celle de l'eau bidistillée sur verre.

4.1. Solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium.

Dissoudre 15 g d'hexacyanoferrate (II) de potassium (K4Fe(CN)6,3H2O) dans l'eau et compléter à 100 ml.

4.2. Solution de sulfate de zinc.

Dissoudre 30 g de sulfate de zinc (ZnSO4, 7H2O) dans l'eau et compléter à 100 ml.

4.3. Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M.

Dissoudre 4,00 g d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans l'eau et compléter à 1 000 ml.

4.4. Tampon triéthanolamine pH 7,6.

Dissoudre 14,0 g de chlorhydrate de triéthanolamine (C6 H15 NO3, HC1). 0,25 g de sulfate de magnésium (MgSO4, 7H2O) dans environ 80 ml d'eau. Ajuster à pH 7,6 avec une solution d'hydroxyde de sodium environ 5 M. Compléter à 100 ml avec de l'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

Réchauffer à environ 25 °C au moment de l'emploi.

4.5. Tampon citrate pH 4,6.

Dissoudre 6,9 g d'acide citrique (C6H8O7,H2O) et 9,1 g de citrate trisodique (C6 H5 Na3 O7, 2 H2O) dans environ 150 ml d'eau. Ajuster à pH 4,6 avec une solution d'hydroxyde de sodium environ 2 M.

Compléter à 200 ml avec de l'eau.

Conservation un an à + 4 °C.

4.6. b-fructosidase (5 mg/ml).

Dissoudre 10 mg de b-fructosidase dans 2 ml de tampon citrate (4.5).

Conservation un an à + 4 °C.

4.7. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP).

Dissoudre 100 mg de NADP-Na2 dans 10 ml d'eau.

Conservation un an à + 4 °C.

4.8. Solution d'adénosine-5'-triphosphate (ATP).

Dissoudre 500 mg d'ATP - Na2 H2, 3H2 O et 500 mg d'hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) dans 10 ml d'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

4.9. Hexokinase/glucose-6-phosphate-déshydrogénase (2mg HK/ml.1mg G-6-PDH/ml), en suspension dans une solution de sulfate d'ammonium 3,2 M.

Conservation un an à + 4 °C.

4.10. Phosphoglucose isomérase (P.G.I.) (2 mg/ml), en suspension dans une solution de sulfate d'ammonium 3,2 M.

L'activité spécifique de la suspension de phosphoglucose isomérase (E.C. 5.3.1.9) doit être d'au moins 350 U/mg à 25 °C avec le fructose-6-phosphate comme substrat.

Conservation un an à + 4 °C.

4.11. Solution de saccharose, glucose, fructose.

Dissoudre 10,000 g de saccharose (C12 H22 O11), 1,000 g de glucose anhydre (C6 H12 O6) et 1,000 g de fructose (C6 H12 O6) dans l'eau et compléter à 100 ml.

5. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

5.1. Balance analytique.

5.2. Bécher d'une capacité de 50 ml.

5.3. Fiole jaugée d'une capacité de 100 ml, classe B.

5.4. Pipettes de précision permettant de délivrer 2-1-0,2-0,05 et 0,02 ml.

5.5. Pipettes de 5 ml graduées au 1/10.

5.6. Entonnoir, diamètre 7 cm.

5.7. Papier filtre, diamètre 15 cm, Whatman n° 40 ou équivalent.

5.8. Film plastique étirable (Type parafilm) pour obturation des cuves.

5.9. Spectrophotomètre réglé à 340 nm et équipé de cuves de 10 mm de parcours optique.

6. Mode opératoire.

6.1. Essai de contrôle.

Si un nouveau lot de réactifs (4.4 à 4.10 inclus) est utilisé, si les réactifs ont été conservés au réfrigérateur sans avoir été utilisés pendant plus de deux semaines, si le travail analytique recommence après une période d'inactivité ou si d'autres conditions peuvent le justifier, l'essai de contrôle suivant doit être effectué.

6.1.1. Introduire à la pipette, 1 ml de la solution de sucres (4.11) dans deux fioles jaugées de 100 ml (5.3) et déterminer la teneur en sucres dans les deux fioles jaugées en appliquant le mode opératoire décrit en 6.3.2, 6.3.3, 6.4 et 6.6.

6.1.2. Calculer les teneurs respectives en glucose, saccharose et fructose exprimées en grammes pour 100 ml selon les formules suivantes :

glucose = delta Ä 9,267

saccharose = delta Ä 17,604

fructuose = delta Ä 9,325

delta A est la différence d'absorbance à 340 nm, calculée comme indiqué au point 6.6.

6.1.3. Compte tenu de la pureté du saccharose, du glucose et du fructose, la valeur retrouvée pour chaque sucre et dans chacune des fioles doit être de 100 7 2 p. 100.

Dans le cas contraire, les réactifs, le mode opératoire, la précision des pipettes, les conditions d'utilisation du spectrophotomètre doivent être vérifiés et les corrections adéquates effectuées.

L'essai de contrôle doit être répété jusqu'à obtention de résultats satisfaisants.

6.2. Prise d'essai.

Peser, à 1 mg près, dans le bécher (5.2) 0,7 à 0,8 g de l'échantillon pour essai.

6.3. Préparation de la solution à doser.

6.3.1. Diluer la prise d'essai dans environ 20 ml d'eau chaude (40 à 50 °C) tout en remuant avec une baguette en verre. Verser quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée (5.3).

6.3.2. Ajouter à la solution (6.3.1) dans l'ordre suivant :

1,0 ml de la solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium (4.1), 1,0 ml de la solution de sulfate de zinc (4.2) et 5,0 ml de la solution d'hydroxyde de sodium (4.3), en mélangeant soigneusement après chaque addition. Refroidir le contenu de la fiole à environ 20 °C. Compléter à 100 ml avec de l'eau, mélanger.

6.3.3. Après trente minutes environ, filtrer sur papier filtre (5.7).

Rejeter les premiers millilitres de filtrat.

6.4. Essai à blanc.

Effectuer un essai à blanc en appliquant le mode opératoire décrit à partir de 6.3, en utilisant tous les réactifs mais en remplaçant la prise d'essai par de l'eau.

6.5. Solution étalon de glucose-saccharose-fructose.

Effectuer un essai avec 1 ml de solution étalon (4.11) en appliquant le mode opératoire décrit à partir de 6.3.

6.6. Détermination.

Introduire à la pipette dans six cuves de mesure (5.9) les filtrats ou les réactifs selon les indications portées dans le tableau ci-après, toutes les mesures étant effectuées contre l'air.

La quantité de sucres (glucose + saccharose + fructose) dans la cuve du spectrophotomètre doit être comprise entre 3 mg et 100 mg.

(tableau non reproduit, voir au Journal officiel).