1. Objet et domaine d'application.

Cette méthode a pour objet de décrire une technique enzymatique permettant de déterminer spécifiquement la teneur en lactose des laits fermentés et des yaourts en présence d'autres glucides et de substances réductrices.

Cette méthode est applicable à tous les produits lactés sucrés.

2. Définition.

La teneur en lactose est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en pourcentage en masse.

3. Principe.

3.1. Défécation.

Précipitation de la matière grasse et des protéines par addition d'hexacyanoferrate de potassium et de sulfate de zinc. L'excès d'ions Zn++ présent est précipité en milieu alcalin puis éliminé par filtration.

3.2. Dosage enzymatique.

Le lactose est hydrolysé en glucose et b-galactose en présence de bêta-galactosidase.

Lactose + H20 / bêta-galactosidase glucose + bêta-galactose

Le b-galactose est oxydé par la nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) en acide galactonique en présence de b-galactose déshydrogénase (Gal-DH) :

bêta-galactose + NAD + / Gal - DH ac. galactonique + NADH + H +

La quantité de NADH formée au cours de la réaction est proportionnelle à la quantité de lactose. Elle est mesurée au spectrophotomètre à 340 nm contre l'air.

4. Réactifs.

Tous les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée pour la préparation des solutions d'enzymes et des échantillons doit être d'une pureté au moins égale à celle de l'eau bidistillée sur verre.

4.1. Solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium.

Dissoudre 15 g d'hexacyanoferrate (II) de potassium dans l'eau et compléter à 100 ml.

4.2. Solution de sulfate de zinc.

Dissoudre 30 g de sulfate de zinc (ZnSO4, 7H2O) dans l'eau et compléter à 100 ml.

4.3. Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M.

Dissoudre 4,00 g d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans l'eau et compléter à 1 000 ml.

4.4. Tampon citrate pH 6,6.

Dissoudre 2,8 g de citrate trisodique dihydraté (C6H5 Na3O7, 2H20), 0,625 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4, 7H2O) dans environ 40 ml d'eau. Ajuster à pH 6,6 avec une solution d'acide sulfurique environ 2 M ou une solution d'hydroxyde de sodium environ 1 M. Compléter à 50 ml avec de l'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

4.5. Suspension de b-galactosidase (d'E. coli) dans une solution de sulfate d'ammonium 2,2 M, pH environ 6.

L'activité spécifique de la suspension de b-galactosidase (EC 3.2.1.23) doit être d'au moins 150 U/ml à 25 °C avec le lactose comme substrat.

Conservation douze mois à + 4 °C.

4.6. Tampon phosphate pH 8,6.

Dissoudre 8,3 g d'hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4) dans environ 40 ml d'eau. Ajuster à pH 8,6 avec une solution d'acide sulfurique (H2SO4) environ 2 M ou une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) environ 1 M.

Compléter à 50 ml avec de l'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

4.7. Suspension de galactose-déshydrogénase (de Ps. fluorescens) dans une solution de sulfate d'ammonium 2,2 M, pH environ 6.

L'activité spécifique de la suspension de galactose-déshydrogénase (EC 1.1.1.48) doit être d'au moins 25 U/ml à 25 °C avec le galactose comme substrat.

4.8. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD).

Dissoudre 100 mg de NAD dans 10 ml d'eau.

Conservation quatre semaines à + 4 °C.

4.9. Solution de lactose hydraté.

Dissoudre dans l'eau 4,5 g de lactose (C12H22O11, H2O) préalablement séché à masse constante à 87 °C, et compléter à 100 ml.

5. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire et notamment :

5.1. Balance analytique.

5.2. Bécher d'une capacité de 50 ml.

5.3. Fiole jaugée d'une capacité de 100 ml, classe B.

5.4. Pipettes de précision permettant de délivrer 2 - 1 - 0,2 - 0,05 et 0,02 ml.

5.5. Pipettes de 5 ml graduées au 1/10.

5.6. Entonnoir, diamètre 7 cm.

5.7. Papier filtre, diamètre 15 cm, Whatman n° 40 ou équivalent.

5.8. Film plastique étirable (type parafilm) pour obturation des cuves.

5.9. Spectrophotomètre réglé à 340 nm et équipé de cuves de 10 mm de parcours optique.

6. Mode opératoire.

6.1. Essai de contrôle.

Si un nouveau lot de réactifs (4.4 à 4.9 inclus) est utilisé, si les réactifs ont été conservés au réfrigérateur sans avoir été utilisés pendant plus de deux semaines, si le travail analytique recommence après une période d'inactivité ou si d'autres conditions peuvent le justifier, l'essai de contrôle suivant doit être effectué.

6.1.1. Introduire, à la pipette, 1 ml de la solution de lactose (4.9) dans deux fioles jaugées de 100 ml (5.3) et déterminer la teneur en lactose dans les deux fioles jaugées en appliquant le mode opératoire décrit en 6.3.2, 6.3.3, 6.4 et 6.6.

6.1.2. Calculer la teneur en lactose exprimée en gramme pour 100 ml selon la formule suivante :

18,873 . delta A

delta A est la différence d'absorbance à 340 nm calculée comme indiqué au point 6.6.

6.1.3. Compte tenu de la pureté du lactose, la valeur retrouvée dans chacune des fioles doit être de 100 7 2 %.

Dans le cas contraire, les réactifs, le mode opératoire, la précision des pipettes, les conditions d'utilisation du spectrophotomètre doivent être vérifiés et les corrections adéquates effectuées. L'essai de contrôle doit être répété jusqu'à obtention de résultats satisfaisants.

6.2. Prise d'essai.

Peser, 1 mg près dans le bécher (5.2), 0,7 à 0,8 g de l'échantillon pour essai.

6.3. Préparation de la solution à doser.

6.3.1. Diluer la prise d'essai dans environ 20 ml d'eau chaude (40 à 50 °C) tout en remuant avec une baguette en verre.

Verser quantitativement le contenu du bécher dans une fiole jaugée (5.3).

6.3.2. Ajouter à la solution (6.3.1) dans l'ordre suivant : 1,0 ml de la solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium (4.1), 1,0 ml de la solution de sulfate de zinc (4.2) et 5,0 ml de la solution d'hydroxyde de sodium (4.3), en mélangeant soigneusement après chaque addition. Refroidir le contenu de la fiole à environ 20 °C. Compléter à 100 ml avec de l'eau, mélanger.

6.3.3. Après trente minutes environ, filtrer sur papier filtre (5.7).

Rejeter les premiers millilitres de filtrat.

6.4. Essai à blanc.

Effectuer un essai à blanc en appliquant le mode opératoire décrit à partir de 6.3 en utilisant tous les réactifs mais en remplaçant la prise d'essai par de l'eau.

6.5. Solution étalon de lactose.

Effectuer un essai avec 1 ml de solution standard (4.9) en appliquant le mode opératoire décrit à partir de 6.3.

6.6. Détermination.

Introduire à la pipette dans trois cuves de mesure (5.9) les filtrats ou les réactifs selon les indications portées dans le tableau ci-après, toutes les mesures étant effectuées contre l'air.

La quantité de lactose dans la cuve du spectrophotomètre doit être comprise entre 5 et 50 mg.

(tableau non reproduit, voir au Journal officiel).