La détermination de l'activité anticholinestérasique des extraits benzéniques du vin ou du jus de raisin est réalisée par la méthode colorimétrique d'Hestrin.

L'acétylcholine réagit avec l'hydroxylamine pour former de l'acide hydroxamique qui, en présence d'ion ferrique, donne un complexe coloré en rouge.

En présence de la pseudo cholinestérase du sérum qui hydrolyse l'acétylcholine, cette réaction ne se produit pas.

En présence d'un composé organophosphoré inhibiteur de l'enzyme, l'hydrolyse de l'acétylcholine ne se produit pas et la réaction est par suite possible.

L'inhibition du volume précis de sérum sanguin utilisé dans la technique étant obtenue par des quantités limitées de chacun des insecticides organophosphorés, la méthode réalisée à partir d'une prise d'essai primitive de 10 ml de vin ou de jus de raisin, subdivisée en deux essais différents correspondant à l'équivalent de 4 et 2 ml de boisson, permet d'apprécier soit :

L'absence d'une dose supérieure à 0,05 mg/l d'insecticide organophosphoré si la réaction est négative ;

La possibilité d'une dose supérieure à 0,25 mg/l d'insecticide organophosphoré si la réaction est positive ;

Enfin, la teneur réelle lorsque l'insecticide est identifié par une technique exécutée séparément.

MATERIEL

Ampoule à décantation de 125 ml.

Bain-marie bouillant.

Tube à essai de 25 ml rodage émeri.

Bain-marie à 37,5° C.

Spectrophotomètre pour mesures dans le visible.

REACTIFS NECESSAIRES

a) Benzène pur redistillé.

b) Solution tampon :

12,52 g de Na2, HPO6, 7 OH8 ou 16,7 g de Na2 HPO4 à 12 OH2.

2,72 g de KH2, PO4.

Eau distillée Q. S. 1 litre.

Le pH doit être égal à 7,2.

c) Solution de brome :

0,4 ml de solution d'eau de brome saturée.

Eau distillée Q. S. P. 100 ml.

d) Solution de pseudo-cholinestérase :

2 ml de sérum sanguin.

Tampon Q. S. P. 25 ml.

e) Solution acétylcholine :

0,138 g chlorhydrate d'acétylcholine.

Tampon Q. S. P. 100 ml.

f) Solution alcaline d'hydroxylamine :

1. Solution de chlorhydrate d'hydroxylamine :

13,9 NH2, OH HC1.

Eau distillée Q. S. P. 100 ml.

2. Solution de soude :

14 g Na OH.

Eau distillée Q. S. P. 100 ml.

Mélanger les solutions 1 et 2 à parties égales.

g) Solution d'acide trichloracétique :

10 g d'acide trichloracétique.

30 ml d'acide chlorhydrique pur.

70 ml d'eau distillée.

h) Solution de perchlorure de fer :

10 g de Fe Cl3, 6 OH2 (ou 22,4 ml de solution Codex).

Acide chlorhydrique 0,1 N Q. S. P. 100 ml.

MODE OPERATOIRE

Extraction

Dans une ampoule à décantation de 125 ml, introduire :

10 ml de vin ou de jus de raisin ;

20 ml de benzène.

Agitez modérément pendant cinq minutes. Laissez reposer. Agitez à nouveau et laissez reposer jusqu'à complète séparation des deux phases. Centrifugez les extraits si une légère émulsion persiste. Vidangez le vin ou le jus de raisin. Décantez la phase benzénique par l'orifice supérieur de l'ampoule dans un petit bécher sec. Prélevez respectivement 8 et 4 ml de l'extrait benzénique et introduisez-les dans deux tubes à essai à rodage émeri. Evaporez juste à sec au bain-marie sous un courant d'air froid projeté au niveau du solvant au moyen d'une canne de verre.

Dosage colorimétrique

Dans une série de tubes à essai à rodage émeri numérotés, introduisez :

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Filtrez et mesurez la densité optique à 540 mn dans des cuves de 1 cm d'épaisseur et par rapport au témoin tube n° 0.

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RESULTATS

1. Les densités optiques Dx 4 et Dx 2 indiquent une inhibition nulle ou inférieure à 5 p. 100.

On peut considérer globalement que ces résultats indiquent que les prises d'essai renferment moins de 0,2 micron de gramme d'insecticide organophosphoré.

Nous avons noté les valeurs suivantes :

0,05 micron de gramme de phosphamidon.

0,14 micron de gramme de parathion.

0,15 micron de gramme de malathion.

En tenant compte de l'essai sur 4 ml de boisson, ce résultat exprime l'absence d'insecticide organophosphoré à des doses supérieures à 0,05 mg/l.

2. Les densités optiques indiquent une inhibition supérieure à 90 p. 100.

S'il est possible de donner une dose moyenne minimale d'insecticide organophosphoré pour la limite inférieure de sensibilité de la méthode, la diversité des produits ne permet pas de donner une dose moyenne pour une inhibition supérieure ou égale à 90 p. 100. Cette dose sera, par exemple, de :

0,5 micron de gramme pour le parathion.

5 microns de grammes pour le phosphamidon.

12 microns de grammes pour le malathion.

La définition de la dose réelle demande une identification parallèle du produit actif.

Dans le cas des quatre produits cités, si Dx 2 montre une inhibition supérieure à 90 p. 100, la teneur sera respectivement supérieure à 0,25-2,6 et 6 mg/kg.

Dans l'ignorance de la qualité de l'insecticide organophosphoré présent, ce résultat pourra être interprété comme l'indication d'une teneur en insecticide organophosphoré supérieure à 0,25 mg/kg.

3. L'une ou les deux mesures Dx 4 et Dx 2 indiquent les inhibitions comprises entre 5 et 90 p. 100.

L'interprétation du résultat dépend également ici de la connaissance du produit actif décelé.

Les deux volumes 2 et 4 ml ont été choisis de manière à augmenter les chances de se trouver, dans l'un des cas, au voisinage de 50 p. 100 d'inhibition.

L'inhibition 50 p. 100 est obtenue respectivement avec :

0,3 micron de gramme de parathion.

0,65 micron de gramme de phosphamidon.

1,8 microns de grammes de malathion.

Après identification du produit existant, sa teneur sera déduite de la droite : pourcentage d'inhibition (en unités probits) par rapport aux logarithmes des doses précisées expérimentalement pour cet insecticide.

La détermination de l'activité anticholinestérasique des extraits benzéniques du vin ou du jus de raisin est exécutée après oxydation préalable à l'eau de brome par la méthode électrométrique de Michel.

La technique consiste à mesurer l'abaissement de pH produit par la libération d'acide acétique.

MATERIEL

Tubes à essai, diamètre extérieur 2 cm, hauteur 11 cm.

pH mètre (de préférence à bande étalée).

Commutateur multiple à main pour mesures alternées de pH.

Quatre électrodes de verre combinées.

Bain-marie avec thermostat à 25° C.

REACTIFS NECESSAIRES

a) Eau de brome : diluez extemporanément 0,2 ml d'eau de brome saturée dans 50 ml d'eau distillée.

b) Tampon de Michel :

Barbital sodique ... 1,237 g.

Phosphate monopotassique ... 0,136 g.

Chlorure de sodium ... 17,535 g.

Eau distillée ... 900 ml.

Ajustez à pH 8 avec 11,6 ml d'HCl 0,1 N et complétez à 1000 ml avec de l'eau distillée.

c) Sérum de poulain filtré sans antibiotique. Ampoule de 10 ml. Institut Pasteur.

Sérum de poulain ... 1 ml.

Tampon de Michel ... 9 ml.

Eau distillée ... 11 ml.

e) Solution de chlorhydrate d'acétylcholine : solution extemporanée à 1 p 100 (0,25 g dans 25 ml d'eau distillée).

f) Solution aqueuse de glycérine à 10 p. 100.

MODE OPERATOIRE

Extraction

Suivre la technique indiquée dans la méthode colorimétrique (3 A).

DOSAGE POTENTIOMETRIQUE

Prenez quatre tubes de 25 ml environ pouvant recevoir chacun une électrode combinée (calomel - verre), introduisez dans les numéros 2, 3 et 4 les volumes désirés d'extrait à analyser représentant 1 et (ou) 2 g d'échantillons, ajoutez 0,1 ml de solution f, évaporez presque à sec ces extraits à basse température et introduisez successivement dans tous les tubes les divers réactifs indiqués sur le tableau suivant :

Repos trois minutes.

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Agitez.

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Laissez hydrolyser trente minutes à 25° C (sans retirer les électrodes).

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NOTA - En raison de l'activité variable et inconnue des échantillons de sérum utilisés, il est conseillé de vérifier cette activité avant l'analyse des extraits. A cet effet, une mesure témoin sera effectuée au préalable, le sérum ne devant être considéré comme valable que si la valeur de l'abaissement du pH est supérieure à 0,8 unité de pH. RESULTATS

La sensibilité de cette technique est supérieure à celle de la méthode colorimétrique. En raison des variations d'activité des produits techniques étalons, les doses inhibitrices suivantes pour le malathion et le parathion sont données à titre indicatif seulement.

1° Inhibition nulle ou inférieure à 5 p. 100.

Les résultats obtenus indiquent que les prises d'essai renferment généralement moins de 0,05 micron de gramme d'insecticide organo-phosphoré.

Nous avons noté par exemple qu'une inhibition de 5 p. 100 était obtenue avec : 0,03 micron de gramme de malathion.

0,01 micron de gramme de parathion produisent une inhibition de 10 p. 100.

2° Inhibition de 50 p. 100.

L'inhibition de 50 p. 100 est obtenue respectivement avec : 0,16 micron de gramme de malathion et 0,08 micron de gramme de parathion.

3° Inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100.

Cette inhibition est constatée respectivement pour : 0,59 micron de gramme de malathion et 0,60 micron de gramme de parathion.

La définition de la dose réelle demande toujours une identification parallèle du produit actif.

NOTA - Technique sans oxydation préalable à l'eau de brome.

La suppression de l'étape d'oxydation à l'eau de brome rend la technique beaucoup moins sensible. A titre d'exemple, pour le parathion et le malathion, les sensibilités sont réduites aux valeurs suivantes :

1° L'inhibition voisine de 5 p. 100 est donnée par : 80 microns de grammes de malathion ou 0,85 micron de gramme de parathion.

2° L'inhibition de 50 p. 100 est donnée par : 400 microns de grammes de malathion ou 8 microns de grammes de parathion.

3° L'inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100 est donnée par :

1,400 microns de grammes de malathion ou 45 microns de grammes de parathion.