Après extraction de l'isopropanol et le cyclohexane, le biphényle est dosé par spectrophotométrie ultra-violette sur le dixième de l'extrait tandis que l'o-phényl phénol est dosé par chromatographie gazeuse ou par colorimétrie sur le reste, après destruction des matières naturelles interférentes extraites.

Réactifs

a) Mélanges acide sulfurique 36° B et eau : aux 2/3, 1/2, 1/5 et 1/10 en volumes.

b) Solution de bichromate de potassium à 3 p. 100 dans l'acide sulfurique au demi.

c) Soude 1 N et 0,1 N.

d) Solution de carbonate de sodium à 5 p. 100.

e) Cyclohexane. Purifiez au laboratoire le produit commercial de qualité "réactif pur" par agitation avec 10 p. 100 de son volume de bichromate sulfurique (réactif b), laissez en contact 1 heure au moins en agitant périodiquement avant de séparer la phase aqueuse. Ajoutez une quantité supplémentaire de bichromate sulfurique si ce réactif est devenu bleu (réduction complète).

Lavez ensuite deux fois le solvant à l'eau distillée, une fois avec la solution de carbonate de sodium (réactif d), enfin deux fois à l'eau distillée.

f) Solution de biphényle à 2, 4 et 8 mg par litre dans le cyclohexane purifié préparées par dilutions successives pour effectuer l'étude du spectre d'absorption entre 200 et 300 nm.

h) Ether de pétrole 40-65° purifié et redistillé.

j) Solution d'o-phényl phénol à 1,0 g par litre dans l'éther de pétrole.

l) Solution aqueuse titrée à 0,2 mg d'o-p p par ml obtenue par dilution au 1/5 d'une solution d'o-phényl phénate de sodium au 1,129 g par litre.

m) Solution diluée d'acide phosphorique à 30 p. 100 en volume (1 ml de cette solution abaisse à un pH voisin de 10,5, 10 ml de soude N).

n) Solution tampon 0,2 M de Soerensen : pH 10,45.

Na2CO3 0,14 M soit 14,85 g par litre.

Na3HCO3 0,06 M soit 5,04 g par litre.

o) Solution à 1 p. 100 de 4 amino antipyrine (à conserver en flacon jaune).

p) Solution à 2 p. 100 de ferricyanure de potassium (extemporanée).

MODE OPERATOIRE

1. Préparation de l'échantillon et extraction

Pesez quatre fruits entiers, détachez entièrement l'écorce et calculez le pourcentage en poids de zestes (100 p). La fraction décimale correspondante étant désignée par la lettre p.

Broyez les zestes et pesez exactement 12,00 g de broyat homogène, 12

quantité équivalente à l'écorce de -- grammes de fruit entier.

p

Introduisez cette prise d'essai dans un flacon de 1 litre à fermeture étanche.

Ajoutez 50 ml d'isopropanol.

Mixez quelques secondes pour homogénéiser.

Ajoutez 30 ml de cyclohexane (qui servent préalablement au rinçage du mixeur).

Ajoutez 2 ml d'acide sulfurique au 1/10.

Agitez mécaniquement pendant 15 mn.

Filtrez le liquide à travers un tampon de laine de verre dans un ballon jaugé de 100 ml. Exprimez les zestes.

Reprenez les zestes broyés avec 25 ml de cyclohexane et agitez mécaniquement pendant 10 mn.

Filtrez le liquide en recevant le filtrat dans le même ballon.

Exprimez les zestes de manière à ajuster à 100 ml exactement.

Homogénéisez le contenu du ballon.

2. Essais qualitatifs

a) Recherche du biphényle

Dans un tube conique gradué de 15 ml muni d'un bouchon rodé introduisez :

1 ml d'extrait cyclohexane-isopropanol.

3 à 4 ml d'eau distillée.

Agitez et après repos notez le volume de la phase cyclohexane séparée (0,5 ml normalement).

Injectez 2 microlitres de cette phase (demeurée dans le tube conique) pour exécuter une chromatographie gazeuse dans les conditions indiquées ci-dessous avec le détecteur à ionisation de flamme :

Chromatographe à détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène ;

Colonne inox 1,50 m - 3,12 mm garnie de 5 p. 100 de SE 30 sur chromosorb W HMDS 60/80 mesh ;

Température du four de la colonne : 135 à 160° C ;

Température de l'injecteur : 140 à 165° ;

Débit du gaz vecteur : azote 20 ml par minute.

Sensible à moins de 10 ng de biphényle, cet essai en permet la perception de moins de 5 mg/kg dans le fruit analysé.

Aucune interférence naturelle surchargeant le pic du biphényle au-dessus de 5mg/kg apparents n'ayant été observée, cet essai informe correctement sur l'opportunité de poursuivre l'analyse pour un contrôle du respect de la tolérance (70 mg/kg).

b) Recherche de l'o-phényl phénol

L'examen de la fluorescence d'une phase aqueuse alcaline séparée de l'extrait cyclohexane-isopropanol renseigne sur la présence d'o-phényl phénol. Cette recherche qualitative sera effectuée dans les conditions du dosage afin d'éviter des manipulations inutiles si son résultat est positif. Elle constitue la phase préliminaire au dosage et sera décrite plus loin, au paragraphe 5, b.

3. Développements de l'analyse

Le développement de l'analyse est conditionné par la nécessité ou non du dosage du biphényle, ainsi que par la possibilité d'utilisation d'un chromatographe, d'où deux éventualités.

a') Le dosage du biphényle est inutile (la chromatographie gazeuse en a montré l'absence ou une teneur très inférieure à la tolérance).

Utilisez la totalité de l'extrait pour l'étude du résidu d'o-phényl phénol.

b') le dosage du biphényle est nécessaire (soit que la chromatographie gazeuse ait révélé sa présence en large quantité, soit que cette mesure n'ait pu être effectuée par défaut de chromatographie).

Il sera prélevé exactement 10 ml d'extrait cyclohexane-isopropanol pour le dosage (ou la recherche et le dosage) du biphényle. La recherche et le dosage de l'o-phényl phénol seront exécutés sur le reste de l'extrait, soit les 9/10 de la prise d'essai.

4. Dosage du biphényle

a) Dosage par chromatographie gazeuse

La recherche qualitative (paragraphe 2-a précédent) renseigne sur la teneur approximative en biphényle et demeure une mesure suffisante si la valeur trouvée est inférieure à 50 mg/kg.

Pour un dosage correct aux teneurs voisines de la tolérance, le dosage par spectrophotométrie est nécessaire.

b) Dosage par spectrophotométrie ultra-violette

Technique avec procédé de purification chimique

Préparation de l'extrait à analyser :

Si l'essai sur l'extrait cyclohexane-isopropanol a été positif, introduisez successivement dans une ampoule à décantation de 125 ml :

20 ml d'eau distillée ;

10 ml de soude N ;

15 ml de cyclohexane, et

10 ml exactement mesurés de l'extrait brut ajusté à 100 ml (soit 1,2

l'équivalent de 1,2 g de zestes ou encore --- g de fruit entier).

p

Agitez vigoureusement et laissez reposer jusqu'à bonne séparation des phases.

Vidangez la phase hydro-alcoolique, lavez la phase organique deux fois avec 5 ml d'eau distillée.

Recueillez la phase organique dans un ballon jaugé de 25 ml, complétez au trait avec 5 ml environ de cyclohexane utilisé au préalable pour rincer l'ampoule et le bécher intermédiaire.

Purification de l'extrait et dosage spectrophotométrique

Dans une ampoule à décantation de 125 ml introduisez 25 ml de bichromate sulfurique (réactif b) et 10 ml de l'extrait ci-dessus ajusté à 25 ml.

Mouillez le bouchon rodé avec une goutte d'acide sulfurique au demi et agitez 1 mn environ à trois reprises au moins. La durée totale du contact sera au moins égale à 1 h et pourra être prolongée quelques heures ou une nuit si les conditions de travail rendent cet intervalle pratique.

Vidangez ensuite la phase aqueuse, lavez successivement la phase organique avec 10 et 5 ml d'eau distillée, ensuite avec 10 ml de solution de carbonate de sodium et enfin avec 10 et 5 ml d'eau distillée.

Décantez le cyclohexane dans un bécher sec renfermant 1 g de sulfate de sodium anhydre et de celui-ci dans un ballon jaugé de 20 ml. Rincez l'ampoule avec 10 ml de cyclohexane et transvasez ce solvant successivement dans le bécher et le ballon jaugé. Complétez à 20 ml et agitez. Effectuez les mesures spectrophotométriques avec des cuves en quartz de 1 cm d'épaisseur.

Tracez le spectre de 200 à 300 nm afin de contrôler l'identité du produit dosé.

Le biphényle présente un maximum d'absorption à 248 nm.

Calcul du résultat

La relation entre la concentration et la densité optique est donnée par la droite d'étalonnage entre 1 et 8 mg par litre :

c = k D248

où

c = concentration en mg de biphényle par litre.

D248 = densité optique mesurée à 248 nm par rapport au cyclohexane dans une cuve de 1 cm d'épaisseur.

Soit D248 la densité optique obtenue, la teneur en biphényle du fruit analysé est égale à :

20 p 25 5 p

Q mg/kg = (k D248 -----) (--- x --) 1.000 = ---- k D248

1.000 1,2 10 0,12

soit pour k = 9,4 par exemple :

Q mg/kg = (5 p) 78,3 D248.

Le rendement de l'ensemble de la technique est égal à 90 plus ou moins 5 p. 100.

La teneur réelle en biphényle des fruits analysés est donc obtenue en multipliant par 1,1 la valeur donnée par l'analyse.

5. Recherche et dosage de l'o-phényl phénol (o-p p).

La présence de l'o-p p est vérifiée par l'examen de la fluorescence très intense, pour des teneurs voisines de la tolérance, de l'extrait alcalin sous lumière ultra-violette.

Le dosage éventuel est exécuté ensuite (après destruction ménagée des substances naturelles) :

Soit par chromatographie gazeuse ;

Soit par colorimétrie au moyen de la réaction d'Emerson (action de la 4 amino antipyrine, en présence d'un oxydant et en milieu alcalin, sur les phénols).

a) Traitement de l'extrait brut

Relargage du cyclohexane

Introduisez la totalité de l'extrait cyclohexane-isopropanol, dans le cas où le dosage du biphényle n'est pas nécessaire ou les 9/10 de cet extrait dans le cas contraire dans une ampoule à décantation de 500 ml. Dans chaque cas, le prélèvement de 1 ml effectué pour la recherche qualitative du biphényle (phase aqueuse et cyclohexane) sera ajouté au contenu de l'ampoule de 500 ml. Ajoutez : 50 ml d'acide sulfurique au 1/10 et 200 ml d'eau distillée.

Agitez vigoureusement. Après repos vidangez la phase aqueuse dans un vase, sans la jetez, et décantez la phase cyclohexane dans un bécher sec de 100 ml et de celui-ci dans une ampoule de 125 ml.

Reversez la phase aqueuse dans l'ampoule de 500 à trois reprises pour l'épuiser successivement avec 15 - 10 et 10 ml d'éther de pétrole avant de la jeter.

Mélangez les extraits éthérés au cyclohexane dans l'ampoule de 125 ml.

Extraction du phényl phénate et vérification de sa présence

Dans une ampoule de 125 ml, épuisez les extraits éther-cyclohexane successivement par 10 et 10 ml de soude N suivis d'une dernière extraction avec 5 ml de soude N dilués par 5 ml d'eau distillée.

Conservez les phases aqueuses renfermant l'o-phényl phénate de sodium.

L'examen sous irradiation ultra-violette (356 nm) de ces solutions aqueuses alcalines renseigne sur la possibilité de présence de l'o-p p.

Les substances naturelles donnent au liquide irradié une légère fluorescence verte, surtout manifeste sur la couche supérieure du liquide irradié.

La présence d'o-p p à une teneur égale à 1 mg/kg dans le fruit donne déjà à la masse du liquide une fluorescence bleue très nette.

Pour des teneurs voisines de la tolérance (10 mg/kg) la fluorescence observée est particulièrement intense.

Destruction ménagée des substances naturelles gênantes

Les phases alcalines, soit au total l'équivalent de 25 ml de soude N sont rassemblées dans une ampoule à décantation de 125 ml.

Neutralisez et acidifiez le milieu par addition de 5 ml d'acide sulfurique au 1/5.

Ajoutez 25 ml d'éther de pétrole purifié.

Agitez.

Ajoutez 10 ml d'acide sulfurique aux 2/3 en volume.

Agitez à plusieurs reprises pendant 5 mn.

Après un repos suffisant pour la séparation des phases, vidangez la phase aqueuse et ajoutez 10 ml d'acide sulfurique aux 2/3.

Agitez à plusieurs reprises pendant 10 à 15 mn, laissez reposer.

Vidangez la phase acide.

Lavez l'éther avec 5 ml d'acide sulfurique au 1/10, puis avec 5 ml d'eau distillée.

La phase éthérée demeurée dans l'ampoule sera traitée différemment selon que l'on désire doser l'o-p p :

par chromatographie gazeuse avec vérification possible par colorimétrie.

ou par colorimétrie seulement.

b) Dosage par chromatographie gazeuse

Conditions opératoires

Colonne 1,5 m 1/8" inox garnie de Carbowax 4000-acide téréphtalique (Wilkens Instrument, Aérograph fournisseur) à 20 p. 100 sur Chromosorb W HMDS 80/100.

Température 160°. - Elution de l'o-p p en 9-10 mn.

Dans ces conditions le temps de rétention relatif de l'o-p p par rapport au biphényle - qui chromatographie également sur cette colonne - est égal à 4,2.

Dosage

Décantez l'éther demeuré dans l'ampoule, dans un bécher de 50 ml et de celui-ci dans un tube conique gradué de 15 ml afin de le concentrer progressivement par évaporation à 2 ml ou à 1,8 ml lorsque 10 ml de l'extrait primitif auront été pris pour le dosage du biphényle.

Rincez l'ampoule et le bécher avec un minimum (5 ml d'éther de pétrole).

Une attention particulière sera portée à réaliser cette concentration sans pertes. Pour cela, il convient d'opérer au-dessus d'un bain-marie sans plonger le tube dans la vapeur, l'évaporation étant obtenue sous jet d'air froid. Le contenu du tube ne devra pas être évaporé à sec, ce qui entraînerait des pertes élevées.

Injectez 2 microlitres d'extrait Calcul concentré à 2 ml ou à 1,8 ml.

Soit n microgrammes par microlitre la teneur en o-p p de l'extrait concentré à 2 ml ou à 1,8 ml. La teneur correspondante en o-p p de fruit analysé est égale à :

n

Q mg/kg = 100 p. --- 0,6

Le rendement de l'ensemble de la technique est égal à 77 plus ou moins 4 p. 100.

La teneur réelle en o-p p des fruits analysés est donc obtenue en multipliant par 1,25 la valeur donnée par l'analyse.

c) Dosage colorimétrique

Etalonnage

Dans six ballons jaugés de 50 ml, introduisez successivement, en agitant après chaque addition : 0 0,5 1 2 3 et 4 ml de solution (1) (soit 0,1 0,2 0,4 0,6 et 0,8 mg d'o-p p) :

Un volume d'eau distillée suffisant pour obtenir approximativement 30 ml de liquide dans chaque ballon.

10 ml exactement de solution tampon (n).

1 ml de chacun des réactifs (o) et (p).

Complétez à 50 ml avec de l'eau distillée.

Déterminez la densité optique à 510 nm en effectuant les mesures avec des cuves de 1 cm d'épaisseur.

Il peut être constaté ici que la densité optique du témoin par rapport à de l'eau distillée est négligeable.

L'étalonnage est traduit par la relation :

q = k'x D510

avec q = mg d'o-p p dans la prise d'essai.

(à titre indicatif K' a été trouvé égal à 1,6 dans les conditions ci-dessus).

Technique

1° Cas d'un contrôle colorimétrique

après chromatographie gazeuse

Dans le tube conique gradué à bouchon rodé renfermant l'extrait éthéré (2 ou 1,8 ml) ajoutez 10 ml de soude N.

Bouchez et agitez.

Après repos, éliminez par aspiration l'éther épuisé. Si nécessaire, éliminez le reste du solvant surnageant par évaporation sous un jet d'air froid.

Transvasez la solution alcaline dans un ballon jaugé de 50 ml, rincez le tube avec 10 ml exactement de solution tampon (n) et 10 ml environ d'eau distillée.

Ajoutez au milieu 1 ml de solution d'acide phosphorique (m).

Introduisez 1 ml de chacun des réactifs (o) et (p), complétez à 50 ml avec de l'eau distillée.

Calcul - La teneur correspondante en o-p p dans le fruit analysé est égale à :

p

Q'mg/kg = -- 1000 (k' D510)

12

10 1

(ou bien les -- de cette valeur lorsque le -- de l'extrait brut a 9 10 été utilisé pour le dosage du biphényle).

Pour tenir compte du rendement de l'ensemble de la technique, la teneur réelle en o-p p du fruit analysé est obtenue en multipliant par 1,25 la valeur donnée par l'analyse.

2° Cas d'un contrôle colorimétrique sans analyse préalable

par chromatographie gazeuse

Si la chromatographie gazeuse n'est pas envisagée, il est inutile de concentrer à 2 ml l'extrait éthéré purifié.

En ce cas, la technique devient :

Après le lavage à l'eau distillée et sans retirer de l'ampoule les 25 ml d'extrait traité à l'acide sulfurique (cf. paragraphe 5, a extrayez le phénate au moyen de 10 et 10 ml de soude N suivis d'un rinçage avec 10 ml d'eau distillée en recevant les phases aqueuses dans un ballon jaugé de 50 ml.

Ajoutez 2,0 ml de solution d'acide phosphorique (m), 10 ml exactement de tampon (n) et 1 ml de chacun des réactifs (o) et (p) en agitant toujours après chaque addition.

Complétez à 50 ml avec de l'eau distillée et mesurez l'intensité de la teinte rouge obtenue à 510 nm et dans des cuves de 1 cm d'épaisseur.

Le calcul est identique au précédent (paragraphe 5, c, 1°).

METHODES DE DOSAGE DU BIPHENYLE ET DE L'O-PHENYL PHENOL

APRES ENTRAINEMENT A LA VAPEUR D'EAU

Se reporter aux techniques décrites dans le Journal officiel des communautés européennes (11 juillet 1967, numéros 148/4 à 148/9).