1. Objet et domaine d'application.

Dosage du benzo (a) pyrène,(3,4-benzopyrène), hydrocarbure aromatique polycyclique dans le café vert et torréfié, en grains ou moulu.

2. Principe.

Extraction du benzo (a) pyrène et purification. Dosage par chromatographie liquide haute pression (C.L.H.P.) avec détection fluorimétrique.

3. Réactifs.

Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

3.1. Cyclohexane.

3.2. Gel de silice 60 granulométrie 0,063 - 0,200 mm (70-230 mesh).

3.3. Gel de silice à 15 p. 100 d'eau (m/m).

3.3.1. Eliminer les impuretés éventuelles du gel de silice (3,2) par chauffage à 500° C dans une capsule en porcelaine pendant huit heures environ.

Laisser refroidir et conserver dans un récipient en verre fermant hermétiquement.

3.3.2. Préparer l'absorbant comme suit, avant l'emploi : peser une certaine quantité du produit (selon le nombre d'analyses à effectuer) dans une fiole et ajouter 15 p. 100 d'eau. Mélanger par agitation pendant au moins vingt minutes et laisser reposer pendant dix à douze heures.

L'absorbant partiellement désactivé, ainsi obtenu, peut être utilisé dans les cinq jours qui suivent sa préparation ; après ce laps de temps, il doit être séché à l'étuve à 130° C pendant une nuit et traité selon 3.3.2..

3.4. Ethanol à 95 p. 100 vol.

3.5. Acétone.

3.6. Acétonitrile.

3.7. Tétrahydrofuranne.

3.8. Hydroxyde de potassium.

3.9. Solution éthanolique d'hydroxyde de potassium 1 M.

Dissoudre 28 grammes d'hydroxyde de potassium (3,8) dans 30 millilitres d'eau. Laisser refroidir et diluer à 500 millilitres avec de l'éthanol (3.4). Cette solution doit être préparée extemporanément.

3.10. Chlorure de sodium.

3.11. Solution saturée de chlorure de sodium.

Dissoudre 40 grammes de chlorure de sodium (3.10) dans 100 millilitres d'eau.

3.12. Sulfate de sodium anhydre.

3.13. Coton de verre.

3.14. Benzo (a) pyrène,(3.4 - benzopyrène).

Note très importante :

Ce produit étant cancérigène, il est obligatoire de prendre toutes les précautions nécessaires lors de son utilisation.

Consulter la fiche toxicologique n° 144 éditée par l'I.N.R.S., 30, rue Olivier-Noyer, 75680 Paris cédex 14 (édition 1980).

3.15. Solutions étalon de benzo (a) pyrène (3.14).

3.15.1. Solution mère.

Préparer une solution à 0,5 mg/ml dans le cyclohexane (3.1).

La solution mère doit être conservée en flacon inactinique et à une température de 5° C. La durée de vie de la solution est limitée à quelques mois.

3.15.2. Solution de référence.

Préparer à partir de la solution mère (3.15.1) une solution contenant 20 nanogrammes de benzo (a) pyrène par millilitre de cyclohexane (3.1). Cette dilution doit être faite extemporanément.

3.16. Phase mobile.

Mélanger 80 parties d'acétonitrile (3.6) avec 20 parties d'eau, filtrer sur membrane (porosité 0,45 micromètre).

Dégazer.

4. Appareillage.

Matériel courant de laboratoire, et notamment :

4.1. Evaporateur rotatif.

4.2. Fioles cylindroconiques de 2 à 5 millilitres, graduées avec bouchons à vis en bakélite et joints téflon.

4.3. Colonnes en verre avec robinet téflon, de longueur 200 millimètres et de diamètre intérieur de 8 millimètres.

4.4. Chromatographe liquide haute pression équipé de :

- un détecteur fluorimétrique avec un monochromateur d'excitation, un monochromateur d'émission ou un filtre d'émission.

A titre d'exemple, les conditions de détection peuvent être :

Longueur d'onde d'excitation : 381 nanomètres ;

Longueur d'onde d'émission : 405 nanomètres ;

- un dispositif d'injection permettant d'introduire une prise d'essai de 10 à 100 microlitres.

- une colonne pour chromatographie liquide haute pression.

A titre d'exemple, on peut utiliser une colonne en acier inox de 250 mm de long, diamètre intérieur de 3 à 4 mm, garnie de silice greffée C 18 (granulométrie 5 à 10 microns de m).

4.5. Seringues pour C.L.H.P..

5. Mode opératoire.

5.1. Extraction et saponification.

Peser une prise d'essai de 25 g de café broyé dans une cartouche de cellulose et extraire au Soxhlet par 200 ml d'acétone (3.5) pendant sept heures. Evaporer le solvant à sec à l'aide de l'évaporateur (4.1). Le résidu est saponifié par 100 ml de potasse éthanolique (3.9) pendant une heure.

5.2. Extraction du benzo (a) pyrène.

Par le réfrigérant, ajouter 200 ml de cyclohexane (3.1) sur la solution encore tiède. Porter à ébullition cinq minutes environ. Transvaser dans une ampoule à décanter de un litre. Ajouter 100 ml d'eau 60° C environ, agiter et laisser décanter.

Si des émulsions se forment, ajouter 10 ml d'éthanol (3.4) ou de solution saturée de chlorure de sodium (3.11). Soutirer la phase aqueuse et laver la phase organique avec précaution en utilisant chaque fois un volume de 100 ml d'eau à 60° C environ jusqu'à disparition de l'alcalinité des eaux de lavage.

Ne pas secouer l'ampoule mais remuer par rotation. Filter la phase organique sur un entonnoir muni de coton de verre (3.13) recouvert d'une couche de 2 à 3 cm de sulfate de sodium anhydre (3.12) et recueillir le filtrat dans une éprouvette graduée de 250 ml.

Noter le volume recueilli Vr. Transvaser dans un ballon à fond rond de 500 ml et concentrer dans un évaporateur rotatif (4.1) jusqu'à 1 ou 2 ml.

5.3. Préparation de la colonne et purification de l'extrait obtenu en 5.2.

5.3.1. Préparation de la colonne.

Dans un bécher de 100 ml, mélanger 5 g de gel de silice (3.3.2) avec 10 ml de cyclohexane (3.1). Verser le mélange dans la colonne (4.3) munie d'un coton de verre. Lorsque le gel de silice s'est déposé, ouvrir le robinet et laisser le cyclohexane s'écouler jusqu'à ce qu'il reste une couche de 0,5 cm sur l'absorbant.

Laver la colonne avec 30 ml de solvant et rejeter le cyclohexane écoulé.

5.3.2. Purification de l'extrait obtenu en 5.2.

Transférer l'extrait concentré 5.2 sur la colonne préparée selon 5.3.1 et rincer plusieurs fois le ballon de 500 ml avec des volumes de 5 ml de cyclohexane (3.1).

Laisser le liquide surnageant s'écouler à travers la colonne et rejeter les 10 premiers millilitres. Eluer le benzo (a) pyrène avec 100 ml de cyclohexane (3.1) que l'on recueille dans un ballon à fond rond de 250 ml ; la vitesse maximale d'écoulement doit être de 2 ml par minute.

Concentrer l'éluat à environ 2-3 ml dans l'évaporateur rotatif (4.1).

Verser le concentrat obtenu dans une fiole graduée (4.2).

Evaporer avec précaution à l'aide d'un courant d'azote jusqu'à 0,5 ml environ.

Laver plusieurs fois les parois du ballon avec des volumes de 2 ml de cyclohexane (3.1), les transvaser dans la fiole (4.2) en répétant chaque fois l'évaporation.

Enfin, évaporer à sec et dissoudre entièrement le résidu dans 400 microns de l de tétrahydrofuranne (3.7) ou d'acétonitrile (3.6).

5.4. Chromatographie.

Effectuer l'analyse à température ambiante dans les conditions définies en 4.4 en utilisant la phase mobile (3.16) avec un débit environ 1,5 ml par minute.

Injecter le même volume (10 à 100 microns de l) de la solution de référence (3.15.2) et de l'extrait obtenu en 5.3.2. Le benzo (a) pyrène est élué après environ 15 minutes.

5.5. Essai à blanc.

Procéder à un essai à blanc avant chaque série d'analyses, en effectuant les opérations décrites en 5.1, sans la prise d'essai, puis en poursuivant selon 5.2, 5.3 et 5.4.

Si l'on observe un pic chromatographique dont le temps de rétention correspond à celui du benzo (a) pyrène, procéder à la purification éventuelle ds solvants selon 5.6, renouveler les autres réactifs et effectuer un nouveau lavage de la verrerie.

5.6. Purification des solvants.

5.6.1. Cyclohexane (3.1).

Evaporer 300 ml dans un évaporateur rotatif (4.1) puis dans une fiole (3.1).

Reprendre le résidu dans 400 microns de l de tétrahydrofuranne (3.7) ou d'acétonitrile (3.6) et procéder à la chromatographie selon 5.4.

Si le cyclohexane est impur, le distiller dans un appareil en verre muni par exemple d'une colonne de fractionnement de 50 cm remplie d'anneaux de Raschig.

5.6.2. Acétone (3.5).

Vérifier la pureté de l'acétone selon 5.6.1 en partant d'un volume de 200 ml.

5.6.3. Ethanol à 95 % vol. (3.4).

Vérifier la pureté de l'éthanol selon 5.6.1 en partant d'un volume de 100 ml.

6. Expression des résultats.

6.1. Mode de calcul et formule.

microns de g de benzo (a) pyrène par kg de café :

hp. ms. V / hs. m. Vpi. f = 1.000.

où hp = hauteur du pic en mm de la solution obtenue en 5.3.2 ;

hs = hauteur du pic en mm de la solution de référence (3.15.2) ;

ms = quantité de benzo (a) pyrène injectée, en ng ;

m = prise d'essai du café, en gramme ;

v = volume de la solution du concentrat en ml obtenue en 5.3.2. ;

Vpi = volume injecté en microns de l ;

f = Vr/200.

6.2. Rendement de l'extraction.

La récupération du benzo (a) pyrène ajouté se situe entre 80 et 100 %.