1. Objet et domaine d'application.
La présente méthode a pour objet de doser la vanilline (hydroxy-4 métho-3 benzaldehyde), l'aldehyde p-hydroxybenzoïque (hydroxy-4 benzaldehyde), l'acide vanillique (acide hydroxy-4 methoxy-3 benzoïque) et l'acide p-hydroxy benzoïque (acide hydroxy-4 benzoïque) dans les gousses de vanille, les extraits et les arômes de vanille, et les sucres vanillés.
2. Principe.
Extraction et/ou dilution puis dosage par chromatographie liquide haute performance (C.L.H.P.), au moyen d'un étalon interne avec détection par spectrophotométrie ultra-violette.
3. Réactifs.
Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
3.1 Alcool à 96 p. 100 vol.
3.2 Méthanol.
3.3 Acide phosphorique dilué 0,01 M.
3.4 Phase mobile : (à titre indicatif). Mélanger 75 parties d'acide phosphorique 0,01 M (3.3) avec 25 parties de méthanol (3.2). Filtrer sur membrane (porosité 0,45mm). Dégazer.
3.5 Etalons de référence à 99 p. 100 de pureté minimale :
3.5.1 Vanilline.
3.5.2 Acide vanillique.
3.5.3 Aldehyde p-hydroxybenzoïque.
3.5.4 Acide p-hydroxybenzoïque.
3.6 Etalon interne : acide acétylsalicylique à 99 p. 100 de pureté minimale.
3.7 Solution mère des étalons : les étalons sont dissous de préférence dans la phase mobile. Les concentrations finales dans la solution mère sont :
3.7.1 Vanilline : solution à environ exactement 0,1 g/l.
3.7.2 Acide vanillique : solution à environ exactement 0,008 g/l.
3.7.3 Aldehyde p-hydroxybenzoïque : solution à environ exactement 0,008 g/l.
3.7.4 Acide p-hydroxybenzoïque : solution à environ exactement 0,002 g/l. La solution ainsi préparée peut se conserver quelques semaines à l'obscurité, à une température de 4 °C.
3.8 Solution étalon interne ; l'acide acétylsalicylique (3.6) est dissous de préférence dans la phase mobile à environ exactement 0,6 g/l. Cette solution doit être préparée extemporanément.
4. Appareillage.
Matériel courant de laboratoire et, notamment :
4.1 Un chromatographe en phase liquide haute performance équipé de :
- un détecteur spectrophotométrique permettant la mesure à une longeur d'onde de 254 nm ;
- un dispositif d'injection permettant d'introduire une prise d'essai de 10 à 100 ml ;
- une colonne pour chromatographie liquide haute performance dont le garnissage est constitué de silice greffée C18 de granulométrie 5 à 10 mm.
4.2 Seringues pour C.L.H.P.
4.3 Dispositif de filtration de petits volumes sur membrane.
5. Mode opératoire.
5.1 Préparation de l'échantillon :
5.1.1 Gousses de vanille : couper les gousses en petits morceaux, extraire par l'alcool à 96 p. 100 vol (3.1) au moyen d'un appareillage approprié. Les quantités de solvant d'extraction et de gousses mises en oeuvre doivent conduire à un extrait de concentration maximale de 100 grammes de gousse par litre. L'extrait obtenu est ramené par dilution à un volume connu dans une fiole jaugée. La solution obtenue est diluée dix fois avec de la phase mobile (3.4).
5.1.2 Extraits, arômes et sucres vanillés : diluer dans la phase mobile (3.4) une prise d'essai de l'échantillon homogénéisé telle que la solution finale contienne environ 0,1 g/l de vanilline.
5.2 Conditions opératoires chromatographiques :
Effectuer l'analyse à température ambiante dans les conditions définies en 4.1 en utilisant la phase mobile (3.4) avec un débit d'environ 1 ml par minute.
5.3 Etalonnage :
5.3.1 Injecter les étalons de référence et l'étalon interne, séparement puis en mélange. Adapter les conditions opératoires de telle sorte que les facteurs de résolution des pics de tous les composés soient au moins égaux à 1.
5.3.2 Injecter l'échantillon tel que préparé en 5.1 après l'avoir filtré sur membrane. Vérifier que l'étalon interne n'interfère avec aucun des constituants de l'échantillon.
5.3.3 Mélanger 10 ml de la solution étalon obtenue en 3.7 avec 10 ml de la solution d'étalon interne (3.8). Filtrer sur membrane et injecter.
Les coefficients de réponse sont donnés par la formule :
Ki =Mi H HeMe H Hi
où :
Ki est le coefficient de réponse du constituant à doser i ;
Mi est la masse du constituant i dans la solution injectée ;
Me est la masse de l'étalon interne dans la solution injectée ;
Hi est la hauteur du pic du constituant i mesurée sur le chromatogramme ;
He est la hauteur du pic de l'étalon interne mesurée sur le chromatogramme ;
(Dans la formule les hauteurs de pics peuvent être remplacées par les surfaces).
5.4 Dosage :
5.4.1 Mélanger 10 ml de la solution échantillon préparée en 5.1 à 10 ml de la solution d'étalon interne (3.8). Filtrer sur membrane.
5.4.2 Injecter la solution obtenue en 5.4.1 dans les conditions fixées en 5.3.3.
Les pourcentages des substances à doser sont déduits de la formule :
Mi = Ki H Hi H MeHe
où :
Mi est la masse du constituant i dans la solution injectée ;
Ki est le coefficient de réponse du constituant i ;
Hi est la hauteur du pic du constituant i ;
Me est la masse de l'étalon interne dans la solution injectée ;
He est la hauteur du pic de l'étalon interne ;
(Dans la formule, les hauteurs de pics peuvent être remplacées par les surfaces).
